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免疫细胞化学染色实验方案
第1阶段 样品制备和固定
样品的固定是 ICC 实验和储存过程中维持细胞形态的重要步骤。
对于盖玻片上培养的细胞
在此过程中，细胞在固定前直接培养在盖玻片上。
所需材料
− 标准盖玻片或多孔板
− 无菌PBS
− 用于包被的蛋白质（例如聚-L-赖氨酸）
− 无菌水
步骤
1. 制备包被溶液并过滤——必要时灭菌。
提示 ：不同的样品类型可能需要不同的蛋白质来帮助粘附。典型的包被溶液是在 PBS 中添加聚-L-赖氨酸 (PLL)、聚-D-赖氨酸 (PDL) 或明胶制备而成。请参阅文献了解您感兴趣的细胞类型和推荐的包被蛋白浓度。
2. 用包被溶液覆盖玻片或平板。
室温下孵育时间通常为1小时至24 时。
提示： 将盖玻片放入组织培养板的孔中，并用包被液覆盖。
3. 用无菌 PBS冲洗盖玻片3次。
提示： 这是为了确保去除盖玻片上的游离蛋白质。
4. 让盖玻片完全干燥。如果需要，在紫外线下消毒至少4小时。
警告：或者，盖玻片可以在包被之前用 70% 乙醇清洗，并在整个过程中使用无菌溶液。
5. 在包被的盖玻片或平板上培养细胞。
6. 确定细胞总数并检查细胞活力。
一般来说，存活率应为 90 - 95%。
7. 准备固定剂，并用选定的固定剂孵育细胞。
| 固定剂时间4% 多聚甲醛（PFA）的PBS溶液室温孵育 10-20 分钟甲醇（95-100%）-20°C 孵育 5 - 10 分钟乙醇（95-100%）-20°C 孵育 5 - 10 分钟丙酮-20°C 孵育 5 - 10 分钟 |
提示：乙醇、甲醇和丙酮会使细胞透化，因此使用这些固定剂前通常不需要另外透化。较长的孵育时间通常会导致较高程度的固定，直至表位可能过度固定。孵育时间短可能会导致表位保存不良和样品固定不足。最佳固定时间需要凭经验确定。
8. 用洗涤缓冲液清洗细胞 3 次。
提示：理想情况下，固定后尽快进行染色。但样品可以保存在 0.1% 叠氮化钠/PBS 中，在 4°C下保存 1-2 周。较长的储存时间可能会缓慢地逆转固定，导致形态较差和表位保存不良。
对于悬浮细胞
对于悬浮细胞，可以在将悬浮液培养到载玻片上之前洗涤并固定细胞。
所需材料
− 细胞悬液
− 聚苯乙烯圆底 12 × 75 mm 2 个Falcon 管/96 孔板（或任何与您的离心机兼容的容器）
− 悬浮液/洗涤缓冲液（例如PBS）
步骤
1. 根据厂商的指导收获和洗涤细胞。
2. 确定细胞总数，并检查细胞活力。
一般来说，存活率应为90 - 95%。
3. 离心，并在冰冷的悬浮缓冲液中重悬细胞样品。
3.1. 在4°C下以约 200 xg 离心5分钟。
提示：旋转时间和速度可能需要优化。
4. 准备固定剂，并用选定的固定剂孵育细胞。
| 固定剂时间4% 多聚甲醛（PFA）的PBS溶液室温孵育 10-20 分钟甲醇（95-100%）-20°C 孵育 5 - 10 分钟乙醇（95-100%）-20°C 孵育 5 - 10 分钟丙酮-20°C 孵育 5 - 10 分钟 |
提示：乙醇、甲醇和丙酮会使细胞透化，因此使用这些固定剂前通常不需要另外透化。较长的孵育时间通常会导致较高程度的固定，直至表位可能过度固定。孵育时间短可能会导致表位保存不良和样品固定不足。最佳固定时间需要根据经验确定。
5. 用洗涤缓冲液清洗细胞3次。
5.1. 将细胞离心成沉淀（200 xg，5分钟，4°C）。
5.2. 每次洗涤后去除上清液并重新悬浮沉淀。
提示：理想情况下，固定后尽快进行染色。但样品可以保存在 0.1% 叠氮化钠/PBS 中，在4°C下保存 1-2 周。较长的储存时间可能会缓慢地逆转固定，导致形态较差和表位保存不良。
6. 将约10 µL悬浮细胞移至载玻片上。
使用的最佳细胞密度取决于所使用的细胞系和实验要求。
此时的典型密度为 10 6 - 10 7 个细胞/mL。
第 2 阶段 透化（可选）
透化作用将部分溶解细胞膜，使抗体能够到达细胞内表位。如果 PFA 用作固定剂，则尤其需要这样做。甲醇等有机溶剂通常会同时透化和固定细胞，因此使用有机溶剂作为固定剂时并不严格要求透化。
所需材料
− 经过相关固定步骤的样品
− PBS
− 洗涤剂（见表1）
− 疏水屏障笔（可选）
步骤
所需时间约20分钟。
1. 根据以下步骤，用 PBS 稀释洗涤剂来制备透化溶液：
表 1：透化用洗涤剂
| 洗涤剂建议浓度时间刺激性清洁剂：Triton X-100、NP-40PBS 中 0.1- 0.2%孵育2-5分钟温和清洁剂：Tween 20、皂苷、毛地黄皂苷、leucopermPBS 中 0.2 - 0.5%孵育2-5分钟 |
警告： Triton X-100 是最常用的用于提高抗体渗透性的去污剂。然而，它通常不太适合膜相关抗原，因为它溶解膜及其相关蛋白。最佳的去垢剂取决于蛋白质及其定位。
应针对所使用的样品优化去污剂的浓度和孵育时间。
如果样品在载玻片上，您可以用PAP笔圈出细胞样品，以帮助汇集试剂。
2. 用透化溶液覆盖细胞并在室温下孵育 2-5 分钟。
提示：如果样品位于载玻片上，您可以用 PAP笔圈出细胞样品，以帮助汇集试剂。
3. 用 PBS 洗涤细胞 3 次。
第三阶段 封闭
在 ICC 中，封闭步骤对于防止图像中的高背景染色特别重要。典型的封闭剂是与二抗宿主物种或BSA相对应的2-10%血清蛋白溶液，其物种依赖性较小，但封闭效率可能较低。封闭液不应含有一抗宿主动物的血清，因为这可能会导致高背景。
所需材料
− 已经历相关固定和透化步骤的样品
− 蛋白封闭剂
− 二抗宿主物种的正常血清
− 牛血清白蛋白（例如，B265991）
− PBS（例如P492453）
− 甘氨酸
步骤
所需时间约2小时。
1. 准备封闭缓冲液。
1.1. 将所选的蛋白质封闭剂溶解在PBS中至2-10 % w/v。
1.2. 加入浓度为0.1 M的甘氨酸（可选）。
| 封闭剂何时使用山羊血清如果用于检测的二抗是在山羊体内产生的驴血清如果用于检测的二抗是在驴体内产生的牛血清白蛋白通常与多种抗体兼容 |
2. 通过在封闭缓冲液中孵育细胞来封闭细胞。
室温孵育1-2 h
警告：如果样品位于载玻片上，您可以用PAP笔圈出细胞样品，以帮助汇集试剂。
3. 继续抗体孵育。
第4阶段 抗体孵化
执行必要的封闭步骤后，您现在就可以用抗体对细胞进行染色了。通常有两个原则：(i) 直接 ICC，其中一抗直接与荧光团缀合，以及 (ii) 间接 ICC，其中使用合适的荧光标记二抗检测一抗。两种方法都有优点和缺点，这里将更详细地讨论。间接 ICC 是最常用的协议。
多色 ICC 涉及使用两组或多组抗体对细胞进行染色，以揭示两种或多种感兴趣蛋白质的分布或共定位。下面给出的间接和直接协议均可适用于多色 ICC。如果间接 ICC 用于多色，强烈建议使用预吸附二抗。这些抗体针对其他物种进行了预吸附，从而最大限度地减少了所用二抗与来自不同物种的一抗发生交叉反应的机会。
间接法
所需材料
− 已经历相关透化/封闭步骤的细胞
− 抗体稀释缓冲液 PBS（例如 P492453）或 PBS-T（含有 0.1% Tween-20 的 PBS，例如 T434505、P196391）
− 洗涤缓冲液 PBS（例如 P492453）或 PBS-T（含 0.1% Tween-20 的 PBS，例如T434505、P196391）
− 一抗
− 偶联二抗
− 疏水性屏障笔——可选用于载玻片或盖玻片上的小细胞体积
步骤
所需时间约13小时30分钟。
1. 确定要使用的最佳抗体稀释度。然后用抗体稀释缓冲液稀释抗体。
抗体数据表上通常会建议最佳稀释度。
警告：您应该进行稀释以确定最有效的抗体浓度。
抗体稀释缓冲液可以仅为PBS。稀释缓冲液还可能含有 0.1% Tween（以降低表面张力）和 1% BSA（作为额外的封闭剂以减少非特异性结合）。
2. 将样品在预稀释的一抗中孵育。
室温孵育 2 小时，或4°C过夜
警告：孵育时间和温度可能需要优化。
提示 1：抗体溶液需要完全覆盖您的样品。
提示 2：使用疏水性屏障笔有助于容纳小体积。
3. 用 PBS 或 PBS-T 清洗载玻片3次。
4. 在抗体稀释缓冲液中制备二抗，并将样品浸入预稀释的二抗中。
室温孵育1小时。
提示 ：可能需要优化孵育时间和抗体浓度。典型的二抗稀释度为 1:1000 或 1:2000 或 0.1-2 µg/mL。对于多色实验，通常可以稀释不同的二抗并一起孵育。如果使用荧光团，则必须在黑暗中孵育以避免光漂白。
5. 用 PBS 或 PBS-T 清洗样品 3 次。
6. 继续复染、封片和成像。
直接法
所需材料
− 已经历相关透化/封闭步骤的细胞
− 抗体稀释缓冲液 PBS（例如 P492453）或 PBS-T（含有 0.1% Tween-20 的 PBS，例如 T434505、P196391）
− 洗涤缓冲液 PBS（例如 P492453）或 PBS-T（含 0.1% Tween-20 的 PBS，例如 T434505、P196391）
− 偶联一抗
− 疏水性屏障笔——可选用于载玻片或盖玻片上的小细胞体积
步骤
所需时间约12小时15分钟。
1. 确定要使用的最佳抗体稀释度。然后在抗体稀释缓冲液中稀释抗体。
提示：抗体数据表上通常会建议最佳稀释度。如果没有，您可能需要进行稀释以找到最有效的抗体浓度。抗体稀释缓冲液可以仅为PBS。我们还建议添加 0.1% Tween（以降低表面张力）和 1% BSA（作为额外的封闭剂以减少非特异性结合）。
2. 将样品浸入预稀释的一抗中。
室温孵育2小时，或4°C过夜。
警告：孵化时间可能需要优化。
提示 1：抗体溶液需要完全覆盖您的样品。
提示2： 使用疏水性屏障笔可以帮助容纳小体积。
3. 用 PBS 或 PBS-T 清洗样品3次。
4. 按照制造商推荐的方案完成任何适当的复染。
第 5 阶段 复染和检测
ICC 过程的最后一步是样品封片并检测信号。这涉及将盖玻片添加到载玻片上（用于盖玻片上的细胞培养物），或将盖玻片覆盖到样本上，以实现成像。
典型的细胞核复染剂是 DAPI （D598342）、HOECHST 33342 （H288601） 或 DRAQ7 （D266297）。还有一些细胞器或细胞骨架复染剂可用（P287444） 。
所需材料
− 用荧光团偶联抗体染色的细胞
− 荧光复染剂（可选，例如：DAPI D598342）
− 适用于荧光检测的封固剂（适用于盖玻片或载玻片上的细胞）
− 密封剂（用于盖玻片或载玻片上的细胞，例如：指甲油）
− PBS（适用于孔中的细胞，例如 P492453）
− 荧光显微镜
步骤
1. 如果需要，将样品浸入复染溶液中。
1.1. 根据制造商的指导在室温下孵育，或直至观察到所需的颜色。
提示：某些封固剂含有荧光复染剂（参见 H288601）。这样就无需单独对载玻片进行复染以添加封固剂。
2. 封固您的样品。
| 样本格式程序盖玻片或显微镜载玻片上的细胞1，在载玻片上添加几滴封固剂并在室温下静置。2，使用镊子将盖玻片放在载玻片上。如果使用水性封固剂，请用柠檬烯或指甲油密封。3，密封后，将载玻片放在荧光显微镜上。细胞在孔中生长1，用 PBS 或存储缓冲液（PBS 中的 0.1% 叠氮化钠）覆盖样品。2，将样品直接置于倒置显微镜下。 |
提示：封片剂通常含有抗淬灭剂，有助于更长时间地保存荧光。
3. 使用适当的激发/发射滤光片组和/或激光器对样品进行成像。
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