工程细胞株开发系列之细胞转染

丹纳赫生命科学

2022.1.21

在工程细胞株开发中，选择好合适的表达体系后，下一步需要让核酸进入细胞并表达目的蛋白。前一篇文章中提到的三种表达体系（微生物、哺乳动物细胞和昆虫细胞），因为转染的方法不同，优化思路与策略也有区别。本文以哺乳动物细胞为例，详细讨论转染方法对比，以及如何优化。下图归纳了常见转染技术。

Part 1

常用转染方法对比

没有一种方法适用于所有的细胞和实验，需要根据细胞类型和实验进行选择。理想的方法应具有高转染效率，低细胞毒性和对正常生理学的影响最小，并且易于使用和具有可重复性等特点。常用于哺乳动物细胞转染的方法有磷酸钙法、阳离子脂质体法、病毒转染法和电穿孔法。

Part 2

转染优化推荐

在正式开展转染实验前要多做预试验，优化转染条件。以脂质体转染优化为例，优化转染条件包括：脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间等等。首先，由于不同质粒和脂质体的最佳搭配比例不同，转染前应该做预实验来摸索一个最佳配比。作预实验时，按照质粒：脂质体=1:1、1:2、1:3、1:4的梯度来检测最佳转染比例，如下表所示：

摸索最佳转染条件需要耗费大量的时间，且手工操作很容易引起误差，在这一步可以考虑使用自动化工作站来替代人工操作。节约时间的同时还可以保证极高的实验稳定性，减少了需要重复实验验证的人力与物力。如何使用自动化工作站优化转染条件，可以参考此文章：高效的转染条件优化：多因子平行

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转染时的细胞密度对转染效率影响非常显著。不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等等。一般转染时贴壁细胞密度为40%-80%。

整个工程细胞株开发过程中，在做细胞培养、转染、筛选时，我们需要时刻关注细胞的活率和状态，但这样的工作人工操作时需要考验检测人员的眼力、耐心和专注力，而且可能会存在一定的人工误差。丹纳赫生命科学旗下贝克曼库尔特生命科学的Vi-CELL BLU 细胞计数和活力分析系统可以全自动进行细胞活力分析与细胞计数，无需人员之手，帮助用户实现标准化的细胞计数和活力分析，是生物制药行业计数和活力测试的标准分析方法之一，其软件满足21 CFR part 11，符合审计追踪的要求。

另一种在工业界应用较多的转染方法是电穿孔法。做电转的时候，如果电压太大，往往会发生细胞大量死亡的情况。不同的细胞，需要的电压是不一样的。对于大多数细胞来说，其最佳电压位于250-1250v/cm。进行转染的细胞应该处于对数生长期。处于对数生长期的细胞的抗损伤能力是最强的。细胞浓度应该处于5x106到1x107/mL之间。每次转染的质粒应该控制在4-6 μg，如果﹥10μg，转染效率也大大降低。

转染成功后需要建立稳转株，上一篇文章中（工程细胞株开发系列之表达系统对比）简单介绍了两种筛选方法：抗生素型与代谢型筛选标记。筛选后的细胞会形成mini pool，但这其中的细胞是异质化的。下一篇文章我们会讲如何从mini pool形成单克隆，并且形成满足申报要求的单克隆源性证明材料。

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