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质粒的生产工艺——从实验室到GMP
质粒是一类小的、双链环装DNA分子，携带染色体以外的遗传信息，由于具有自我复制功能，被广泛应用于生物制药领域。在细胞基因治疗产品中，质粒是构建病毒载体及目标基因转入的关键传递载体。在治疗或预防性药物中，质粒又可以作为终产品注入人体内，进行目标蛋白的表达。早在2017年，全球范围内以裸质粒型基因治疗药物的临床方案（包含DNA疫苗）就达到了428个，随着临床成功的级别不断提升，以及产品在进入后期临床研究阶段上的进步，行业对质粒DNA的需求量不断上升。相应的，对于质粒DNA的生产和质控也提出了更高的要求。
质粒DNA的生产包括一系列的工艺步骤，为了确保质粒制备的适宜条件，需要前期开展大量的条件摸索，包括大肠杆菌的培养条件优化。实验室规模的大肠杆菌培养有很多局限性，特别是缺少培养过程监控，导致过程参数无法被实时控制。目前，实验室规模的大肠杆菌培养更多采用摇瓶培养这种终点检测法，这对深入理解并优化工艺参数是十分不利的。后续工业化生产不仅要求高产量，而且对质粒的质量（如超螺旋百分比）、生产成本以及工艺可放大性提出了更高的要求。而这一切的基础就是对培养过程的深入理解与优化。丹纳赫生命科学旗下贝克曼库尔特生命科学的BioLector Pro微流控高通量微型生物反应器，可以在微孔板上进行完整的生物工艺控制，它采用一次性48位微孔板，具有在线测量生物量、荧光、pH和溶氧值(DO) 等数据的功能，同时还能通过微阀控制器和微流控通道控制 pH 和补料速率，很好地解决传统摇瓶及生物反应罐通量低、费时费力费原料或发酵过程为暗箱的难题，并可成功放大到1L和20L搅拌式生物反应器上。
BioLector Pro
微流控高通量微型生物反应器
BioLector Pro – 大肠杆菌补料
发酵WR培养基，37℃，800 rpm，pH值=6.4，单向pH控制 (NaOH)，补料速率=5L/h 葡萄糖(500 g/L)，5h后开始补料梅花板 (FlowerPlate)
在实验室阶段的菌液的收集可采用离心机来完成。在离心过程中，对于样品的保护和提高回收效率是非常重要的，有些样品在离心收集后，由于与离心管壁贴合不紧密，在转子减速过程中很容易再次悬浮起来，造成沉淀的回收率降低。贝克曼库尔特生命科学的 Avanti J-15R制冷型台式高效离心机，内置 Ultra Harmonic Technology (UHT) 超平稳离心技术，能够智能加减速，减少样品扰动重悬，实现样品保护并提高回收得率。另外Avanti J-15R的转头可选配生物安全密封盖及Aerosolve透明密封杯，防止气溶胶污染。
Avanti J-15R高效离心机 Aerosolve生物安全密封杯
Avanti J-15R 菌液离心结果
在质粒DNA的GMP生产中，考虑到效率和放大的问题，菌液的收集一般采用中空纤维或微滤膜包，然后采用一次性混合器Wandmixer进行菌体碱裂解，接着采用大肠杆菌重组RNase来去除RNA。考虑到成本问题，一般是采用CaCl2絮凝及NH4HCO3沉淀的方式，通过深层过滤以及除菌过滤得到澄清料液，从而进行捕获层析，然后结合产品的实际情况选择不同的工艺进行精制纯化，此时会得到比较纯的质粒，接下来进行超滤浓缩，制剂混合，最后进行除菌罐装。丹纳赫生命科学旗下Pall拥有从菌液收获到除菌过滤的质粒纯化及制剂混合和除菌罐装的方案。
Pall的质粒纯化方案
另外，在菌体裂解后，还可使用贝克曼库尔特超速离心机搭配NVT 100/90/65 近垂直转头（k因子小，可大幅度缩短离心时间），采用CsCl密度梯度离心方法可实现mg级到g级无内毒素超螺旋构象质粒的纯化，大大提高后续转染效率。
目前，多种先进技术已用于获得大量纯化的质粒产品，相应地安全性和符合监管的要求也日臻完善，其中高质量、高纯度的超螺旋质粒是确保基因制剂安全性和有效性的前提条件，也是质粒检测的关键质量属性。EMEA，FDA以及中国都对用于基因制剂的质粒DNA中超螺旋百分比含量有一定的要求。
使用丹纳赫生命科学旗下SCIEX 的PA 800 Plus毛细管电泳制药分析系统，结合激光诱导荧光检测器（LIF）和dsDNA 1000 试剂盒，可以对质粒的三种拓扑结构进行高效分离，并能准确计算超螺旋百分比，用于质粒的纯度检测。
毛细管电泳配置激光诱导荧光检测器对质粒三种拓扑结构进行分析
PA 800 Plus毛细管电泳制药分析系统与dsDNA 1000 试剂盒
生物制药的快速发展，促进了行业对质粒的需求增长，丹纳赫生命科学具有一系列从实验室研究到GMP生产的质粒工艺及质控方案，来满足日益增长的质粒DNA生产的需要。
声明：此文版权为丹纳赫生命科学所有，如需转载请联系。
