2022上半年Monolith国内用户文献来啦！裂解液、离子、双结合位点检测应有尽有！

2022上半年使用Monolith发表的国内文献接近100篇，小编按照疾病机制，结构生物学和植物科学三个方向选取了10篇文章分享给大家。

以下文章包含细胞裂解液，无标记，超大复合物，离子以及双结合位点检测等应用，希望会对大家的实验有所帮助。

疾 病 机 制 01

北京大学朱健课题组

必需氨基酸受体抵御非酒精性脂肪肝病的作用机制

常规认知中，脂肪肝多见于营养过剩的肥胖人群。但事实上，消瘦人群也有可能因营养不良而患上脂肪肝病。2022年3月3日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心朱健课题组在Molecular Cell在线发表了题为"Amelioration of hepatic steatosis by dietary essential amino acid-induced ubiquitination" 的研究论文。研究人员发现了肝细胞中一种重要的必需氨基酸受体Ubr1。当必需氨基酸摄入不足时，Ubr1蛋白的生理功能受到抑制，导致肝脏脂肪的积累并发展为脂肪肝病。Ubr1作为一种E3泛素连接酶，其生理功能在结合必需氨基酸后被激活，催化Plin2脂滴保护蛋白的泛素化降解，从而缓解肝脏肝脏脂肪的积累。

研究人员通过Monolith无标记互作实验证明Ubr1可以区分必需和非必需氨基酸：精氨酸、赖氨酸等7种必需氨基酸能够直接结合Ubr1并激活其功能。其中，亮氨酸 (Leu) 和异亮氨酸（Ile）与Ubr1结合能力最强, 亲和力（Kd）接近于已报道的氨基酸受体 (Sestrin2/CASTOR1)；与之相对，非必需的缬氨酸（Val）无法结合Ubr1。

这些结果也在细胞水平实验中得到验证：在食物中补充亮氨酸或异亮氨酸，能够明显缓解由禁食诱导产生的细胞内Plin2蛋白水平升高和脂肪积累。该研究表明，补充这两种必需氨基酸在预防由营养不良导致的脂肪肝病中具有重要作用，Ubr1蛋白也是非酒精性脂肪肝病的潜在治疗靶点。

Monolith检测Ubr1与氨基酸互作

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.01.021

02

上海中医药大学屈祎课题组

结肠癌Wnt/β-catenin信号通路中药小分子抑制剂

Wnt/β-catenin信号通路是公认的肿瘤驱动因子，但β-catenin缺乏常见的小分子结合深疏水口袋，是个典型的“不可成药”蛋白。2022年2月1日，上海中医药大学屈祎课题组在Cell Reports在线发表了题为"Liquidambaric acid inhibits Wnt/β-catenin signaling and colon cancer via targeting TNF receptor-associated factor 2" 的研究论文。本研究发现中药路路通活性分子路路通酸 (LDA) 抑制Wnt信号通路和结肠癌，并利用蛋白质谱技术找到了LDA的潜在靶标蛋白肿瘤坏死因子受体相关因子2 (TNF receptor-associated factor 2，TRAF2)。

接下来研究人员使用Monolith分子互作仪验证了TRAF2与LDA的直接相互作用（左图）。为了进一步探究LDA的结合位点，研究人员表达了不同结构域的GFP标签蛋白直接在细胞裂解液中检测。结果显示LDA与缺少TRAF-C domain以及删除TRAF-C domain 408–431氨基酸（△408–431）的蛋白间并无相互作用，仅与TRAF-C domain（TRAF2-TC）作用（右图）。

 Monolith检测TRAF2与LDA亲和力

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110319

03

北京大学杜鹏课题组

植物免疫蛋白通过挽救miRNA缺陷实现广谱抗肿瘤反应

2022年5月26日，北京大学杜鹏课题组在Cell在线发表了题为"A plant immune protein enables broad antitumor response by rescuing microRNA deficiency" 的研究论文。

该研究发现，在不同的人类原发性癌症样本和癌症细胞系中，不能有效结合AGO2复合体的3’末端短1-nt的miRNA异构体广泛积累。异位表达的植物免疫蛋白RDR1通过其单核苷酸加尾修饰这些AGO2游离出的miRNA双链异构体，以重新激活有缺陷的miRNA通路，从而特异性阻断实体瘤和白血病中癌细胞的细胞周期。作者发现3'末端短1-nt的miRNA异构体广泛积累，而这些异构体相比于2-nt悬垂的异构体与AGO2的亲和力更低。

作者在这里分别使用了EMSA与Monolith互作实验进行了验证，这种短1-nt的异常miRNA不能有效进入AGO2中，并且不稳定，与不同肿瘤中的miRNA剂量减少有关。

Monolith检测rAGO2与miRNA亲和力

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.04.030

结 构 生 物 学 04

北京大学毛有东课题组

蛋白酶体与去泛素化酶动态调控机制

2022年4月27日，北京大学毛有东课题组在 Nature 在线发表了题为"USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM" 的研究论文。

研究人员通过时间分辨冷冻电镜技术，揭示了与去泛素化酶动态调控人源蛋白酶体（proteasome）的机制。去泛素化酶USP14通过可逆结合蛋白酶体26S被激活，剪切底物上的泛素链，被认为是一个潜力巨大的癌症和神经退行性疾病的靶标。北京大学毛有东教授团队通过时间分辨冷冻电镜技术，揭示了与去泛素化酶动态调控人源蛋白酶体的机制。

在阐述USP14被蛋白酶体26S激活的机制的过程中，研究团队利用Monolith分子互作仪检测了超大复合物蛋白酶体26S与USP14的相互作用，并在溶液体系中轻松检测三元互作，验证了底物对于USP14-26S亲和力的影响。

Monolith检测USP14与蛋白酶体结合

https://doi.org/10.1038/s41586-022-04671-8

05

清华大学Jiang Xin课题组

葡萄糖转运蛋白抑制剂

人类葡萄糖转运体GLUTs的表达升高，尤其是GLUT1和GLUT3，与促进癌细胞的过度增殖相关，因此GLUT抑制剂具有潜在的抗癌治疗作用。2022年5月12日，清华大学Jiang Xin及普林斯顿大学颜宁课题组共同通讯在Nature Communications 在线发表了题为"Molecular basis for inhibiting human glucose transporters by exofacial inhibitors" 的研究论文。该研究报告了一种 GLUT3 的变体GLUT3exo，可用于筛选和验证外表面抑制剂。

随后研究团队鉴定了一种外表面 GLUT3 抑制剂 SA47，并通过Monolith分子互作仪检测SA47与GLUT3及其突变体的相互作用，验证了晶体结构中揭示的抑制剂作用位点。该研究为发现用于治疗开发的 GLUTs 表面抑制剂提供了结构生物学基础。Monolith分子互作仪检测不依赖于分子量变化，非常适合于小分子互作的检测。

Monolith检测SA47与GLUT3蛋白WT和突变体的亲和力

https://doi.org/10.1038/s41467-022-30326-3

06

北京生命科学研究所郑三多课题组

多巴胺受体与配体的识别机制

多巴胺受体广泛分布于中枢神经系统，是各种精神神经疾病的重要治疗靶点。2022年6月8日，北京生命科学研究所郑三多课题组Nature Communications在线发表了题为"Ligand recognition and biased agonism of the D1 dopamine receptor" 的研究论文。本研究通过冷冻电镜技术揭示了D1多巴胺受体(D1R)-Gs复合物的三个结构。

文中揭示了D1R有两个单独的结合位点可容纳fenoldopam分子，分别位于正位结合袋(OBP)和扩展结合袋(EBP)，并通过Monolith分析得到与结构观察一致的结果。对于亲和力不同的双结合位点的靶标分子与配体相互作用，使用Monolith分析软件可分别拟合计算不同结合位点的亲和力。

多巴胺受体D1R具有两个单独的结合位点可容纳fenoldopam分子

https://doi.org/10.1038/s41467-022-30929-w

07

四川大学华西医院杨胜勇课题组

G蛋白偶联受体（GPCR）- 大麻素受体CB1独特的变构调节机制

作为中枢神经系统中表达量最高的G蛋白偶联受体（GPCR）之一，大麻素受体CB1是治疗焦虑、肥胖、疼痛和神经退行性疾病等诸多疾病的潜在药物靶点。前期研究发现，CB1的变构结合位点（allosteric site）为CB1调控药物的开发提供了新方向。但是，CB1变构调节的具体分子机制尚不清楚，严重阻碍了变构药物的研发。

2022年5月30日，四川大学华西医院杨胜勇课题组在Nature Chemical Biology在线发表了题为"Molecular mechanism of allosteric modulation for the cannabinoid receptor CB1" 的研究论文。四川大学华西医院杨胜勇和邵振华团队采用晶体衍射与冷冻电镜技术，成功解析出CB1与变构调节剂ZCZ011以及下游信号转导分子G_i相互作用的精细结构，在CB1变构调节机制研究领域取得重大进展。

研究者通过对CB1序列进行点突变、片段插入等一系列改造，成功表达出可结晶的CB1蛋白。接下来又通过Monolith分子互作仪快速确认了经过序列优化的CB1蛋白仍然具有与ZCZ011的结合能力。Monolith检测时无需固定样品，直接在溶液中检测，可以避免固定对膜蛋白等脆弱样品活性的影响。

Monolith检测CB1–CP55940与ZCZ011亲和力

https://doi.org/10.1038/s41589-022-01038-y

植 物 科 学 08

北京大学瞿礼嘉课题组

植物防止多精受精的分子机制

2022年1月20日，北大生命科学学院瞿礼嘉课题组在Science在线发表了题为"RALF peptide signaling controls the polytubey blockin Arabidopsis" 的研究论文，揭示了拟南芥中通过限制多花粉管靶向胚珠（多个花粉管到达一个胚珠）来防止多精受精的分子机制。植物是如何限制数以百计的花粉管进入同一个胚珠，防止多精受精的呢？当受精失败后又如何进行“受精补偿”呢？

作者研究发现位于花柱道隔膜处(雌性)表达的FERONIA、ANJEA和HERCULES受体与花粉管（雄性）特异性分泌的RALF6、7、16、36和37小肽配体相互作用来建立阻止“多花粉管穿出”的“屏障”，只允许一根花粉管靶向胚珠。花粉管进入胚珠，爆裂释放精子后，RALF小肽迅速减少，进而解除花柱道隔膜处的“屏障”。从而在受精失败时，可使第二根花粉管穿出花柱道，进行受精补偿。

研究团队使用Monolith分子互作仪对RALF6和RALF36与受体FER、ANJ和HERK1的亲和力进行测定，快速准确的验证了RALF6/36是受体FER、ANJ和HERK1的配体。

Monolith检测RALF6/36与受体FER、ANJ和HERK1的亲和力

https://doi.org/10.1126/science.abl4683

09

北京大学李毅课题组

微量元素铜增强水稻抗病毒分子机制

铜是植物生长发育的重要调节剂，然而铜对病毒入侵的反应机制尚不清楚。北京大学生命科学学院李毅课题组在 Science Advances 在线发表了题为 "The key micronutrient copper orchestrates broad-spectrum virus resistance in rice" 的研究论文。课题组之前的研究表明，SPL9介导的miR528转录激活为已建立的AGO18- miR528 - L- AO抗病毒防御增加了一个调控层。研究发现，Cu²⁺通过抑制SPL9的蛋白水平来抑制miR528的转录激活，进而提高ROS水平，增强AO积累量及其酶活，从而加强抗病毒反应，阐明了铜稳态的分子机制、调控网络以及SPL9-miR528-AO抗病毒途径。

为了检测SPL9和Cu²⁺之间的直接相互作用，作者纯化了SPL9 DNA结合区域（SPL9 SBP），使用Monolith分子互作仪检测其与Cu²⁺的互作。结果显示SPL9 SBP直接与Cu²⁺结合，但不与Ca²⁺结合。

Monolith检测SPL9与Cu²⁺亲和力

https://doi.org/10.1126/sciadv.abm0660

10

中国农业大学杨淑华课题组

低温特异钙信号的感知和应答机制

暴露在寒冷的环境中会触发细胞质Ca²⁺的激增，导致植物的转录重编程。然而，Ca²⁺信号是如何被感知和传递到下游的低温信号通路仍然是未知的。2022年6月29日，中国农业大学杨淑华及丁杨林课题组共同通讯在 Science Advances 在线发表了题为"CPK28-NLP7 module integrates cold-induced Ca2+ signal and transcriptional reprogramming in Arabidopsis" 的研究论文。研究发现，钙依赖性蛋白激酶28 (CPK28)启动了一个磷酸化级联，从而作用于低温诱导Ca²⁺信号下游的转录重编程。这项研究阐明了一种先前未知的机制，揭示了植物从质膜到细胞核的快速感知和转导低温信号的关键策略。

研究中，作者通过Monolith分子互作仪检测到CPK28可直接与Ca²⁺结合，而CPK28 EF-hand位点突变蛋白CPK28EFm与Ca²⁺亲和力降低了6倍，证明了EF-hand对结合Ca²⁺非常重要。

Monolith检测CPK28/CPK28^EFm与Ca²⁺的亲和力

https://doi.org/10.1126/sciadv.abn7901

关于Monolith新一代分子互作检测仪 

德国NanoTemper公司自2010年推出第一款基于微量热泳动技术的Monolith分子互作仪。随着工业用户的增多且对高通量检测的需求越来越迫切，NanoTemper公司于2014年推出了自动化的检测仪器Monolith NT.Automated。基于用户的反馈，在2020年对该产品线进行了全面升级，推出了全新的Monolith系列仪器。

产品特点：

• 仅需微量样品，即可直接在溶液中测定分子间结合。

• 无需固定，不受检测样品种类的限制。

• 检测速度快、测量范围广 (K_d : 从pM到mM)。

• 仪器操作简单，无需繁琐的清洗维护。

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参考文献：

[1] Qi Y, Ding L, Zhang S, Yao S, Ong J, Li Y, et al. A plant immune protein enables broad antitumor response by rescuing microRNA deficiency. Cell. 2022 2022/05/26/;185(11):1888-904.e24.

[2] Yan R, Zhu H, Huang P, Yang M, Shen M, Pan Y, et al. Liquidambaric acid inhibits Wnt/beta-catenin signaling and colon cancer via targeting TNF receptor-associated factor 2. Cell Reports. 2022;38(5). PubMed PMID: 110319.

[3] Zhang Y, Lin S, Peng J, Liang X, Yang Q, Bai X, et al. Amelioration of hepatic steatosis by dietary essential amino acid-induced ubiquitination. Molecular Cell. 2022 2022/04/21/;82(8):1528-42.e10.

[4] Zhang S, Zou S, Yin D, Zhao L, Finley D, Wu Z, et al. USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM. Nature. 2022 2022/05/01;605(7910):567-74.

[5] Wang N, Zhang S, Yuan Y, Xu H, Defossa E, Matter H, et al. Molecular basis for inhibiting human glucose transporters by exofacial inhibitors. Nature communications. 2022;13(1):2632. PubMed PMID: 35552392.

[6] Teng X, Chen S, Nie Y, Xiao P, Yu X, Shao Z, et al. Ligand recognition and biased agonism of the D1 dopamine receptor. Nature communications. 2022;13(1):3186. PubMed PMID: 35676276.

[7] Yang X, Wang X, Xu Z, Wu C, Zhou Y, Wang Y, et al. Molecular mechanism of allosteric modulation for the cannabinoid receptor CB1. Nature Chemical Biology. 2022 2022/05/30.

[8] Zhong S, Li L, Wang Z, Ge Z, Li Q, Bleckmann A, et al. RALF peptide signaling controls the polytubey block in Arabidopsis. Science. 2022;375(6578):290-6.

[9] Yao S, Kang J, Guo G, Yang Z, Huang Y, Lan Y, et al. The key micronutrient copper orchestrates broad-spectrum virus resistance in rice. Science Advances. 2022;8(26):eabm0660.

[10] Ding Y, Yang H, Wu S, Fu D, Li M, Gong Z, et al. CPK28-NLP7 module integrates cold-induced Ca2+ signal and transcriptional reprogramming in Arabidopsis. Science Advances. 2022;8(26):eabn7901.