CRISPR-dCas9基因表达调控

一、原理及应用介绍

     CRISPR/Cas9系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的sgRNA介导Cas9核酸酶靶向目标序列，对序列进行切割。Cas9的核酸酶剪切活性取决于两个结构域：RuvC和HNH。当这两个结构域同时处于失活状态时，Cas9将不具有核酸酶活性，成为dCas9(dead Cas9)。CRISPR-dCas9系统即是dCas9与转录激活因子（如VP64、VPR、SAM或SunTag）或转录抑制因子（如KRAB）融合后，结合sgRNA能促进或抑制目的基因的表达。

图1. CRISPR-dCas9系统调控内源基因的转录激活与抑制（Gilbert LA,et al.,Cell,2013）

应用领域

CRISPR-dCas9转录激活：可实现目的基因在内源环境中过表达、诱导iPSC、激活沉默基因、遗传缺陷补偿等；

CRISPR-dCas9转录抑制：可实现抑制目的基因表达、分析代谢途径、敲低特定基因转录量以研究基因功能、可与CRISPR/Cas9 Gene Knockout或RNAi技术联合作用等。

应用案例

1.基因敲低（CRISPRi）和基因敲除（CRISPRn）效率的比较

     Mandegar等人通过比较Tet-on调控dCas9-KRAB的基因敲低（CRISPRi）与Tet-on调控Cas9的基因敲除（CRISPRn），发现CRISPRi对NANOG的抑制效果更快且更完全。主要是由于CRISPRn的敲除存在很大的效率问题，在iPS细胞系中NANOG受抑制的仅60%–70%的细胞，而CRISPRi能达到99%以上。

图2. 基因敲低（CRISPRi）和基因敲除（CRISPRn）效率的比较（Mandegar MA,et al.,cell stem cell,2016,modified）

2.dCas9-VPR能显著提高内源性基因的表达

     Chavez等人将dCas9与三种激活因子VP64-P65-Rta（VPR，VP64：疱疹病毒转录因子，P65：NFкB信号通路的成员，Rta：EB病毒激活因子）融合，通过特异性靶向目的基因的sgRNA能特异性的提高内源性基因（MIAT, NEUROD1, ASCL1和RHOXF2）的转录水平，起到激活基因的目的。与dCas9-VP64相比效果更加显著。

图3. dCas9-VPR能显著提高内源性基因的表达（Chavez A,et al.,Nature methods,2015）

二、我司提供病毒载体及细胞系构建服务

服务内容

1. sgRNA的设计；

2. 细胞内sgRNA剪切活性检测；

3. 依据不同需求选择不同载体的构建：

     a、CRISPR-dCas9转录激活载体的构建：sgRNA-dCas9-VP64/VPR表达质粒

     b、CRISPR-dCas9转录抑制载体的构建：sgRNA-dCas9-KRAB表达质粒

4. 依据所要编辑的细胞选择不同导入方式：

     a、脂质体易转染细胞：使用质粒系统

     b、脂质体难转染细胞：使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染

5. RT-PCR检测目的基因的转录水平。

服务流程

需客户提供内容/材料

1、目的基因序列（基因ID）以及物种来源；

2、需介导转录激活或抑制的细胞（可选）；

3、病毒类型选择以及要求；

4、血清型选择。

表1.服务信息及最终交付内容、产品

声明：枢密科技提供的所有基因编辑服务及该服务的后续研究，仅适用在国家法律和伦理规范的范围内实施。禁止用于任何人体或临床实验的研究；禁止用于对人类生殖体系进行基因修饰的研究；禁止将基因修饰的其他动物胚胎及生殖细胞植入人体。客户如违反相关法律规定，本公司不承担任何法律责任。

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途