一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，四种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后8 h 更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,感染Hela细胞后定量PCR检测病毒滴度。体内和体外实验对慢病毒滴度的要求不同，生产过程中可以通过浓缩得到不同滴度的慢病毒颗粒。
二、 实验材料1、慢病毒载体、包装细胞和菌株慢病毒载体系统（
Tronolab）：
该病毒包装系统为四质粒系统，组成为pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G, 目的干扰质粒。其中目的干扰质粒能表达绿色荧光蛋白（GFP）. pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包装所必须的元件.
细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
菌株 大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
2、主要试剂 | 试剂名称 | 生产厂家 | 货号 |
| 包装细胞293T细胞株 | 中科院上海细胞所 | |
| 大肠杆菌菌株DH5α | Invitrogen公司 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen公司 | |
| 胰蛋白酶 | Invitrogen公司 | |
| 限制性内切酶 | Fermentas | |
| T4 DNA连接酶 | NEB公司 | M0202V |
| 质粒DNA提取试剂盒 | Axygen公司 | |
| 制备感受态试剂盒 | BIOSCIENCES | |
| 凝胶回收试剂盒 | Qiagen公司 | |
| 1kb/100bp ladder | Fermentas | |
3、主要仪器| 仪器名称 | 生产厂家 | 货号 |
| PCR仪 | Applied Biosystems公司 | |
| 电泳仪 | Bio-rad公司 | |
| 荧光倒置显微镜 | 奥林帕斯 | |
| 冷冻超速离心机 | Hitachi | |
| 细胞培养箱 | healforce | |
| 凝胶成像仪稳压DNA电泳仪 | Tianneng | |
| 恒温摇床 | | |
| 电热恒温培养箱 | | |
| 移液器 | eppendorf | |
| 电热恒温水浴锅 | 上海一恒实验设备有限公司 | |
| 数码凝胶处理系统 | 天能科学仪器 | |
| 一次性平皿 | Cell-star | |
| 烧瓶 | | |
三、慢病毒载体系统质粒基本信息和图谱该病毒包装系统为四质粒系统，组成为pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G, 目的穿梭质粒。其中穿梭质粒（目的穿梭质粒）含有能表达绿色荧光蛋白（GFP）；pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包装所必须的元件。
四、 慢病毒生产实验步骤1、慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293 T细胞，细胞密度为0.5×10时；重新接种于25 mL的15cm细胞培养皿，37℃，50 mL/L CO2培养箱内培养；
2、制备慢病毒包装系统中四种质粒DNA溶液；
pRsv-REV 10 μg，
pMDlg-pRRE 15 μg，
pMD2G 7.5 μg,
干扰质粒 20 ug
加入无菌水定容至1800 μL, 再加入CaCl
2 (2.5 mol/L) 溶液200 μL，混匀，加入2×BBS缓冲盐溶液2000 μL，室温放置20～30 min；
3、当细胞密度达60%～70%时转染. 将DNA和磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养12 h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS 15 mL，轻摇后弃去，重复该步骤3次.；
4、每瓶细胞中加入含100 mL/L小牛血清的细胞培养液15 mL，继续培养48 h.；
5、收集转染72 h的293T细胞上清液；
6、将收集的上清液于4℃，4000 g离心10 min，收集上清液；
7、将各种不同RNA干扰质粒上清液以0.45 μm滤器过滤；
8、于40 mL超速离心管中，4℃，25000 r/min离心20 min；
9、而后以冰PBS液，分别溶于500ul Dmem,和500ul PBS重旋病毒沉淀于4℃溶解过夜
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