反映细胞增殖情况；通常连续检测5天，获得细胞增殖曲线；检测细胞增殖最经济常用的方法，MTT只适用于贴壁细胞，MTS/CCK8可用于悬浮细胞。

技术原理

活细胞特别是增殖期细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT（即黄色噻唑兰）还原成难溶于水的蓝紫色针状Formazan结晶并沉淀在细胞中，且Formazan的形成量与细胞活力成正比，二甲基亚砜（DMSO）能够溶解Formazan结晶，用酶标仪在特定波长处测定其吸收值，即可间接反映细胞增殖情况。MTS及WST–8（CCK-8试剂）都是新型唑类化合物，和MTT一样，同样都能被细胞线粒体中的脱氢酶还原，MTS及WST–8被还原后的Formazan化合物具有高度水溶性，无需再用加DMSO，可直接用酶标仪在特定波长处测定吸收值。

因还原生成的甲臜物数量与活细胞的数量成正比，MTT、MTS、CCK-8均可用于细胞增殖的检测，目前被广泛应用于抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

结果展示

为研究某基因是否是某肿瘤细胞增殖相关的关键基因，可将目的基因shRNA慢病毒感染靶细胞，使靶细胞内源表达的目的基因表达下调，随后用MTT进行检测，观察目的基因表达下调后的细胞与对照细胞相比细胞增殖的变化，从而推断结论。

MTT 实验结果图

用待研基因shRNA慢病毒感染A375细胞，3天后收集细胞，按2000/孔的细胞数量接种细胞至96孔板，第二天待细胞贴壁后，开始进行MTT检测，连续检测5天，获得细胞增殖曲线。结果显示，shRNA下调目的基因表达后，细胞增殖显著减缓，表明待研基因与A375细胞增殖显著相关。

参考文献

Suventha Moodley,Neil A. Koorbanally,Thrineshen Moodley.The 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay is a rapid, cheap, screening test for the in vitro anti-tuberculous activity of chalcones. Journal of Microbiological Methods. 2014,104:72–78.

细胞增殖及相关服务

服务流程

服务说明

细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖、遗传的基础，是细胞最基本的生理活动。生长因子、激素及癌基因产物等均可诱导细胞的增殖或抑制细胞的增殖，通过影响细胞周期的运行、细胞凋亡的改变而实现。

MTT检测细胞增殖

MTT为一种化合物，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在 490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，因此MTT的吸光值可间接反映活细胞数量。该方法已广泛用于抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
吉凯实验实例：
不同基因的过表达慢病毒感染细胞，继续培养三天后，收集对数期细胞，向96孔板每孔加入2000个细胞，细胞培养箱孵育至细胞贴壁,向孔板中加入MTT溶液，并继续培养4h。最后去除MTT，加入二甲基亚砜溶解MTT，酶标仪读取OD490时的吸光值。

CON：未处理细胞实验组；
NC：对照慢病毒感染实验组；
OE：目的基因过表达慢病毒感染实验组。
结论：目的基因过表达后，细胞生长受到抑制。
收费标准：2250元/组，MTT检测在96孔板中进行，60孔为一组实验。

克隆形成实验

是测定细胞的增殖能力的有效方法之一。单个细胞在体外持续6代以上，其后代所组成的细胞群称为克隆。这时每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3~1.0mm之间，通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，了解细胞的增殖能力和独立生存能力。常用的方法有：平板克隆形成实验和软琼脂形成实验。
吉凯基因实验实例：
1、平板克隆形成：分别将阴性对照靶点和目的基因有效靶点慢病毒感染细胞，四天后，将处于对数生长期的细胞消化，计数后在6孔板培养板中接种500个细胞/孔，静置培养2周，中途隔3天换液并观察细胞状态，出现肉眼可见的克隆即终止培养，用多聚甲醛固定1h，再用Giemsa染色后，计数大于10个细胞的克隆。得到的实验结果如下：
 
实验结论：感染了目的基因靶点病毒的细胞，克隆形成能力减弱。

2、软琼脂克隆形成：分别将阴性对照靶点和目的基因有效靶点慢病毒感染细胞，四天后，将处于对数生长期的细胞消化；在孔板底部铺0.6%的琼脂糖，上层使用0.3%的琼脂糖和细胞的混液，置入培养箱中继续培养10天。把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。得到的实验结果如下：

实验结论：感染了目的基因靶点病毒的细胞，克隆形成能力减弱。
收费标准：375元/well。

细胞周期

指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期测定细胞周期的方法很多，最常用的是PI渗入测定细胞周期。PI ,即碘化丙锭,可以与细胞内DNA 和RNA 结合,采用RNA酶将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的 G0/G1 期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA 含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为 G0/G1 期,S 期和G2/ M 期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率。
应用实例
分别将阴性对照靶点和目的基因有效靶点慢病毒感染细胞，继续培养四天后，洗涤消化并用预冷的70% 乙醇溶液固定细胞，1h后，PI染色，流式细胞仪检测，得到的周期实验结果：
实验结论：感染目的基因靶点病毒后，细胞处于G1期的细胞显著增加，处于S期的细胞显著减少，提示目的基因与细胞的周期分布显著相关。
收费标准：375元/well。

细胞凋亡

是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程。
原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），用流式细 胞仪即可检测凋亡细胞。细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏；Annexin V染色法不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V法更加省时，简单，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。
吉凯实验实例：
诱导凋亡药物紫杉醇处理乳腺癌MCF7细胞8小时后，消化并收集细胞，用PBS洗涤细胞三次，加入annexin V-APC染色，流式细胞仪检测。  



左图为对照组，右图为加药处理组
收费标准：Annexin V单染实验费：375元/well；Annexin V和PI双染实验费：460元/well

MTT MTS CCK8细胞增殖及相关服务价格

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