C309 标准查询与下载

T/CI 372-2024 高性能模压碳碳平板技术规范

本文件规定了高性能模压碳碳平板的结构形式、工艺路线、材料选择、技术要求、实验方法以及检验、包装等要求。 本文件适用于适以短碳纤维为原料，模压成型结合快速液相增密工艺过程制备的高性能碳碳平板和产品质量控制。

Technical specification of high-performance molded carbon carbon flat plates

T/NXZX 006-2024 工业硅粉

本文件适用于矿热炉内炭质还原剂与硅石熔炼所生产的工业硅粉，主要用于配制合金、制取多晶硅和生产有机硅等。

Industrial Silicon Powder

T/CSTM 00897-2024 土壤调理材料用凹凸棒石

本文件规定了土壤调理材料用凹凸棒石的术语和定义、要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存。 本文件适用于制备土壤调理材料用的凹凸棒石产品。

Attapulgite for soil conditioning materials

T/CSTM 01211-2024 凹凸棒石基生物有机肥

本文件规定了凹凸棒石基生物有机肥的术语和定义、要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存。 本文件适用于以凹凸棒石黏土为原料，经配料、搅拌、造粒、整形、烘干、筛分、涂膜、包装而成的凹凸棒石基生物有机肥产品。

Attapulgite based microbial organic fertilizer

T/CSBM 0047-2024 医疗器械表面肝素抗 Xa/Ⅱa 因子活性和含量试验方法

5 试验方法 5.1 抗 Xa/Ⅱa 因子活性 5.1.1 原理 肝素与AT-Ⅲ形成复合物，抑制过量添加的Xa/Ⅱa因子的活性，发色底物与剩余Xa/Ⅱa因子特异性结合，水解释放对硝基苯胺（pNA），在405nm处的吸光度与反应体系中的肝素浓度成反比。 5.1.2 试验步骤 5.1.2.1 标准曲线的制作 使用按照《中华人民共和国药典》（2020年版 四部）配置的pH为8.4的三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6 000缓冲液配置不同浓度的肝素钠标准溶液，加入抗凝血酶溶液使肝素钠浓度在0 IU/mL～3 IU/mL范围内，然后加入Xa/Ⅱa因子溶液和发色底物溶液，37 ℃孵育2 min～20 min后，加入醋酸溶液终止反应，立即测量反应液在405nm处的吸光度值，以肝素钠浓度的对数值为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，采用线性方程进行拟合。 5.1.2.2 试验样品测试 取样品置于试管中，参照5.1.2.1步骤，将样品的吸光度值带入标准曲线，计算得到样品的肝素浓度。 5.1.3 结果分析 按式（1）计算样品肝素抗Xa/Ⅱa因子活性总量（Q1）： ??1 = ?? × ??  ···········································································(1) 式中： Q1——样品肝素抗 Xa/Ⅱa 因子活性总量，单位为 IU； C——样品肝素浓度，单位为 IU/mL； V——缓冲液体积，单位为mL。 5.2 肝素含量 5.2.1 方法一 5.2.1.1 原理 肝素在水溶液中由于其酸性基团的解离而高度带负电荷，甲苯胺蓝和肝素钠在水溶液中会发生静电结合，未被结合的甲苯胺蓝在最大吸收波长处的吸光度与肝素钠浓度呈线性关系。 5.2.1.2 试验步骤 5.2.1.2.1 标准曲线制作 将肝素钠用生理盐水或PBS缓冲液在0μg/mL～30μg/mL范围内配置成不同浓度的标准溶液，然后加入甲苯胺蓝溶液（0.002％～0.0002％，w/v），室温下孵育3 min～10min后测定甲苯胺蓝最大吸收波长处的吸光度值。以肝素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，采用线性方程进行拟合。 5.2.1.2.2 试验样品测试 取带肝素涂层和无涂层的同种材料样品置于试管中，然后参照5.2.1.2.1步骤，将测试的吸光度值带入标准曲线，计算得到样品的肝素浓度。应进行无涂层的同种材料样品测试，扣除背景材料影响。 5.2.2 方法二 5.2.2.1 原理 在酸性条件下，利用亚硝酸钠的强氧化性降解涂层中的肝素分子使其氨基己糖结构脱氨并产生醛基，然后加入3-甲基-2-苯并噻唑酮腙（MBTH）与之发生化学反应，最后产生具有蓝色的MBTH偶联物，反应液最大吸收波长处的吸光度与肝素钠浓度呈线性关系。 5.2.2.2 试验步骤 5.2.2.2.1 标准曲线制作 将肝素钠用生理盐水或PBS缓冲液在0μg/mL～100μg/mL范围内配置成不同浓度的标准溶液，加入等体积的亚硝酸钠溶液和乙酸溶液37℃反应60 min以上，然后依次加入等体积的氨基磺酸铵溶液、MBTH和氯化铁溶液后，测试在628 nm～632 nm处的吸光度。以肝素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，采用线性方程进行拟合。 5.2.2.2.2 试验样品测试 取带肝素涂层和无涂层的同种材料样品置于试管中，然后参照5.2.2.2.1步骤，将测试的吸光度值带入标准曲线，计算得到样品的肝素浓度。应进行无涂层的同种材料样品测试，扣除背景材料影响。 5.2.3 结果分析 按式（2）计算样品表面肝素含量（Q2）： ??2 = (??1 ? ??0) × ?? ·····································································(2) 式中： Q2——肝素含量，单位为μg； c0——无涂层样品背景浓度，单位为μg/mL； c1——涂层样品肝素浓度，单位为μg/mL； v——溶剂体积，单位为mL； 注：以重量单位表示肝素含量旨在客观定量描述涂层化学组成，并非关联肝素活性或抗凝性能。 6 报告 试验报告应包括但不限于以下内容： a) 样品的识别； b) 样品制备方法； c) 测试方法； d) 测试条件； e) 测试结果。

Test method for anti-Xa/Ⅱa activity and content of medical device surface heparin

T/CSBM 0050.2-2024 创面修复材料有效性评价 第 2 部分：水不溶性材料体外浸提液评价方法

4 浸提液制备 在无菌状态下，按照以下条件制备浸提液： a) 浸提温度：37 ℃±1 ℃； b) 浸提时间：24 h±2 h 或 48h±2h 或 72h±2h； c) 浸提介质：无血清培养基； d) 浸提条件：120 r/min 摇床中震荡； e) 样品和浸提介质的比例：按照 GB/T 16886.12—2023 中表 1 的规定进行。 5 细胞增殖试验 5.1 原理 在无血清培养基条件下测定细胞增殖的情况，以无血清培养基为空白对照，含血清培养基为阳性对照。若材料具有促进细胞增殖的作用，则和空白对照相比具有明显细胞增殖反应。 5.2 器具、试剂和耗材、细胞系 5.2.1 器具 试验器具如下： a) 二氧化碳细胞培养箱； b) 恒温水浴摇床； c) 高压蒸汽灭菌锅； d) 倒置荧光显微镜； e) 细胞计数仪； f) 恒温水浴摇床； g) 酶标仪； h) 电子天平； i) 液氮罐； j) 冷冻离心机； k) 96 孔板； l) 细胞培养瓶或细胞培养皿。 5.2.2 试剂和耗材 试验试剂和耗材如下： a) 含 10％新生胎牛血清 DMEM 低糖培养基（含 10％FBS DMEM 低糖培养基）； b) 无血清培养基； c) CCK-8 试剂。 5.2.3 细胞系 5.2.3.1 试验可使用的细胞系如下： a) 成纤维细胞； b) 皮肤上皮细胞； c) 食管上皮细胞； d) 胃黏膜上皮细胞； e) 肠黏膜上皮细胞。 5.2.3.2 对于用于不同部位的修复材料选择合适的细胞系，如用于皮肤的修复材料可用皮肤细胞，用于食管的材料可选择食管上皮细胞。 5.3 样品制备 5.3.1 试验样品 将浸提液使用无血清培养基稀释成100％、75％、50％、25％、12.5％的浓度。 5.3.2 阳性对照 含10％FBS DMEM低糖培养基，37 ℃、120 r/min摇床中震荡24 h。 5.3.3 空白对照 无血清培养基，37 ℃、120 r/min摇床中震荡24h。 5.4 试验方法 将在对数生长期内的细胞按照1×105个/mL的细胞密度加入到96孔板内，每孔100 μL，6个复孔。在细胞培养箱中培养24h后弃去旧培养基，按照表1规定加入对照组和试验组溶液。于24h、48h和72h分别观察细胞增殖情况，弃去孔内液体，加入CCK-8溶液，放入培养箱内孵育3h。孵育结束使用酶标仪测量450 nm的吸光度值，按照式（1）计算细胞增殖率，评估试验样品溶液不同浓度对细胞的增殖作用，并筛选出最佳增殖浓度。 表1 细胞增殖试验 ??1 =??450 ????/??450 ????× 100％·································································(1) 式中： P1——细胞增殖率，％； A450 nm——阳性对照组不同浓度样品组平均吸光度； B450 nm——空白对照组平均吸光度。 5.5 结果分析 采用统计学方法评价试验结果，并对空白对照组、试验组和/或阳性对照品组各组结果进行综合分析评估。经统计学分析： a) 在阳性对照和空白对照应有显著性差异（p＜0.05）条件下，试验组和空白对照组比较 p＜0.05，则认为该材料具有促进细胞增殖的效果，否则材料没有促进细胞增殖的作用； b) 若阳性对照和空白对照没有显著性差异（p＞0.05），则试验不成立。 6 细胞迁移试验 61 原理 当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个细胞空白区域，即为“划痕”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。通过对不同时期划痕区域细胞状态的观察，对细胞的迁移能力进行判断。该方法模拟了细胞在体内愈合过程中的迁移过程。在细胞单层中创建一个“伤口”，在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像以关闭伤口，以及比较图像以确定细胞迁移速率。 5.2 器具、试剂和耗材、细胞系 6.2.1 器具 试验器具如下： a) 二氧化碳细胞培养箱； b) 恒温水浴摇床； c) 高压蒸汽灭菌锅； d) 倒置荧光显微镜； e) 细胞计数仪； f) 恒温水浴摇床； g) 酶标仪； h) 电子天平； i) 液氮罐； j) 24 孔板； k) 细胞 T75 培养瓶； l) Image J 图像处理软件。 6.2.2 试剂和耗材 试验试剂和耗材如下： a) 含 10％新生胎牛血清 DMEM 低糖培养基（含 10％FBS DMEM 低糖培养基）； b) 无血清培养基。 6.2.3 细胞系 同5.2.3。 6.3 样品制备 同5.3。 6.4 试验方法 按照表2规定将处于对数生长期的细胞按照1×105个/mL的细胞密度铺于24孔板内，每孔加入1 mL，3个复孔，24 h后将一灭菌直尺放置于孔板孔上方，用1 mL枪垂直于孔板和直尺间划一道横线，在10×显微镜下观察，拍摄0 h、以及培养12 h、24 h时细胞图片，应用Image J按式（2）计算不同时间的细胞迁移率，评估生物材料作用后的对细胞迁移的影响。 表2 细胞迁移试验 ??2 =(??0???12/??24)/??0× 100％·······························································(2) 式中： P2——细胞迁移率，％； S0——细胞划痕后0 h细胞未覆盖的区域面积； S12——细胞划痕后12h细胞未覆盖的区域面积； S24——细胞划痕后24h细胞未覆盖的区域面积。 6.5 结果分析 采用统计学方法评价试验结果，并对空白对照组、试验组和/或阳性对照品组各组结果进行综合分 析评估。经统计学分析： a) 在阳性对照和空白对照应有显著性差异（p＜0.05）条件下，试验组和空白对照组比较 p＜0.05，则认为该材料具有促进细胞迁移的效果，否则材料没有促进细胞迁移的作用； b) 若阳性对照和空白对照没有显著性差异（p＞0.05），则试验不成立。

Effectiveness evaluation of wound repair materials Part 2:In vitro extracts evaluation method for water insoluble materials

T/CSBM 0050.3-2024 创面修复材料有效性评价 第3部分：刺激因子屏蔽评价方法

4　刺激物浓度确定试验 4.1原理 将刺激物溶解在培养基中，配成不同梯度已知浓度的样品，按照GB/T 16886.5测定刺激物不同浓度下的细胞毒性，确定刺激物存活率40％、50％和60％的浓度。 4.2器具、试剂和耗材、细胞系、刺激物 4.2.1　器具 试验器具如下： a)二氧化碳细胞培养箱； b)恒温水浴摇床； c)高压蒸汽灭菌锅； d)倒置荧光显微镜； e)细胞计数仪； f)恒温水浴摇床； g)酶标仪； h)电子天平； i)液氮罐； j)冷冻离心机； k)96孔板； l)细胞培养瓶或细胞培养皿。 4.2.2　试剂和耗材 试验试剂和耗材如下： a)含10％新生胎牛血清DMEM低糖培养基（含10％FBS?DMEM低糖培养基）； b)二甲基亚砜（DMSO）； c)异丙醇； d)高密度聚乙烯。 4.2.3　细胞系 4.2.3.1试验可使用的细胞系如下： a)成纤维细胞； b)皮肤上皮细胞； c)食管上皮细胞； d)胃黏膜上皮细胞； e)肠黏膜上皮细胞。 4.2.3.2对于用于不同部位的修复材料选择合适的细胞系，如用于皮肤的修复材料可用皮肤细胞，用于食管的材料可选择食管上皮细胞。 4.2.4　刺激物 试验可使用的刺激物如下： a)盐酸； b)胃蛋白酶； c)胰蛋白酶； d)过氧化氢； e)细菌内毒素； f)其他。 4.3样品制备 4.3.1　刺激物梯度溶液 准确称取刺激物溶解在含10％FBS?DMEM低糖培养基中，配置成不同梯度浓度的刺激物，过滤除菌低温保存备用。根据样品现有的细胞毒性数据，配置10个不同梯度浓度的刺激物。 4.3.2　阴性对照 计算直径为1?cm的高密度聚乙烯双面的面积，按3?cm2/mL加入含10％FBS?DMEM低糖培养基，37?℃、120?r/min摇床中浸提24?h，取上清液使用。 4.3.3　阳性对照 取适量DMSO加入含10％FBS?DMEM低糖培养基内，制备10％DMSO溶液，37?℃、120?r/min摇床中震荡24?h。 4.3.4　空白对照 含10％FBS?DMEM低糖培养基，37?℃、120?r/min摇床中震荡24?h。 4.4试验方法 按照GB/T 16886.5—2017中附录C规定的MTT细胞毒性试验方法进行，处理条件、检测模型、观察时间按表1进行。试验设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、刺激物组，每个试验组设置6个复孔。将复苏好的成纤维细胞传至两代以上呈对数生长期时，按照1×105个/mL密度制备细胞悬液，每孔加入100?μL细胞悬液，然后接种到96孔板内，放入二氧化碳细胞培养箱在37?℃下培养24?h，移去旧培养基，按照试验设置加入对应培养液，继续培养24?h后，在显微镜下观察每组细胞形态，弃去每组培养液后加入1?mg/mL?50?μL?MTT溶液，放入细胞培养箱中孵育3?h后弃去孵育液，加入100?μL异丙醇，用振荡器上振荡使蓝紫色结晶充分溶解混匀，在酶标仪上检测570?nm和650?nm波长的吸光度值并按照式（1）计算细胞存活率。 表1 细胞毒性试验 　() 式中： P1——细胞相对存活率，％； A570?nm——阴性对照组在570?nm处的平均吸光度； A650?nm——阴性对照组在650?nm处的平均吸光度； B570?nm——阳性对照组在570?nm处的平均吸光度； B650?nm——阳性对照组在650?nm处的平均吸光度。 4.5试验用刺激物浓度的确定 根据细胞毒性试验结果，做刺激物浓度和细胞毒性关系曲线，选择细胞毒性存活率40％、50％、60％的3个浓度用于物理屏蔽细胞活力和物理屏蔽细胞迁移试验。若试验结果的细胞毒性存活率未能达到以上要求，宜进一步增加浓度或降低浓度重新进行细胞毒性试验。 5　物理屏蔽细胞活力试验 5.1原理 采用Transwell细胞培养技术评价创面修复再生材料对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、过氧化氢、细菌内毒素等刺激因子屏障作用。物理屏蔽保护试验模式如图1所示。在有保护材料屏蔽的情况下可以避免刺激因子对细胞的刺激和毒性作用，细胞可以生长良好，而在没有保护的情况下细胞生长被抑制或细胞死亡。 a）加入材料                          b）未加材料 图1　材料屏蔽保护试验模型示意图 5.2器具、试剂和耗材、细胞系 5.2.1　器具 试验器具如下： a)二氧化碳细胞培养箱； b)恒温水浴摇床； c)高压蒸汽灭菌锅； d)倒置荧光显微镜； e)细胞计数仪； f)恒温水浴摇床； g)酶标仪； h)电子天平； i)液氮罐； j)冷冻离心机； k)24孔板； l)Transwell孔板； m)96孔板。 5.2.2　试剂和耗材 试验试剂和耗材如下： a)含10％新生胎牛血清DMEM低糖培养基（含10％FBS?DMEM低糖培养基）； b)CCK-8试剂。 5.2.3　细胞系 同4.2.3。 5.3刺激物溶液制备 按4.5确定的浓度，按4.3.1配制3个浓度的刺激物溶液。 5.4试验方法 按照表2规定将处于对数生长期的细胞按照1×105个/mL的细胞密度铺于24孔板内，每孔加入1?mL，3个复孔，试验组的Transwell孔板中加入0.2?mL保护胶使其厚度为1.0?mm～1.5?mm，空白对照组不做处理，分别向每组中加入3个不同浓度的刺激物观察24?h、48?h、72?h细胞增殖情况，酶标仪下检测450?nm的吸光度，按照式（2）计算细胞存活率，评估创面修复材料屏蔽保护细胞活力作用。 表2　物理屏蔽细胞活力试验 　() 式中： P1——细胞存活率，％； A450?nm——试验组在450?nm处的平均吸光度； B450?nm——空白对照组在450?nm处的平均吸光度。 5.5结果分析 采用统计学方法评价试验结果，并对空白对照组、试验组结果进行综合分析评估。经统计学分析试验组和空白对照组比较p＜0.05则认为该材料具有屏蔽保护细胞活力的作用，否则材料没有屏蔽保护细胞活力的作用。 6　物理屏蔽细胞迁移试验 6.1原理 采用Transwell细胞培养技术评价创面修复再生材料对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、过氧化氢、细菌内毒素等刺激因子屏障作用。物理屏蔽保护试验模式如图1所示。在有保护材料屏蔽的情况下可以避免刺激因子对细胞的刺激和毒性作用，细胞可以迁移，而在没有保护的情况下细胞迁移被抑制。 6.2器具、试剂和耗材、细胞系 6.2.1　器具 试验器具如下： a)二氧化碳细胞培养箱； b)恒温水浴摇床； c)高压蒸汽灭菌锅； d)倒置荧光显微镜； e)细胞计数仪； f)恒温水浴锅； g)恒温水浴摇床； h)酶标仪； i)电子天平； j)液氮罐； k)24孔板； l)Transwell孔板； m)细胞培养瓶； n)Image J图像处理软件。 6.2.2　试剂和耗材 含10％新生胎牛血清DMEM低糖培养基（含10％FBS?DMEM低糖培养基）。 6.2.3　细胞系 同4.2.3。 6.3刺激物溶液制备 同5.3。 6.4试验方法 按照表3规定将处于对数生长期的细胞按照1105个/mL的细胞密度铺于24孔板内，每孔加入1?mL，3个复孔，24?h后将一灭菌直尺放置于孔板孔上方，用1?mL枪垂直于孔板和直尺间划一道横线，在10×显微镜下观察。样品组的Transwell孔板中加入0.2?mL的保护胶使其厚度为1.0?mm～1.5?mm，空白对照组不做处理，分别在每组中加入3个不同浓度的刺激物。拍摄0?h、以及培养12?h、24?h时的细胞图片，应用Image J按式（3）计算不同时间的细胞迁移率，评估生物材料作用后的对细胞迁移的影响。 表3　物理屏蔽细胞迁移试验 　() 式中： P2——细胞迁移率，％； S0——细胞划痕后0?h细胞未覆盖的区域面积； S12——细胞划痕后12?h细胞未覆盖的区域面积； S24——细胞划痕后24?h细胞未覆盖的区域面积。 6.5结果分析 采用统计学方法评价试验结果，并对空白对照组、试验组结果进行综合分析评估。经统计学分析试验组和空白对照组比较p＜0.05则认为该材料具有屏蔽保护促进细胞迁移的作用，否则材料没有屏蔽保护促进细胞迁移的作用。

Effectiveness evaluation of wound repair materials Part 3:In vitro irritants barrier evaluation method

T/CSBM 0050.1-2024 创面修复材料有效性评价 第 1 部分：水溶性材料体外评价方法

4 细胞毒性试验 4.1 原理 将待测生物材料溶解在培养基中，配成不同梯度浓度的样品，按照GB/T 16886.5—2017确定不同浓度下材料是否具有细胞毒性。 4.2 器具、试剂和耗材、细胞系 4.2.1 器具 试验器具如下： a) 二氧化碳细胞培养箱； b) 恒温水浴摇床； c) 高压蒸汽灭菌锅； d) 倒置荧光显微镜； e) 细胞计数仪； f) 恒温水浴摇床； g) 酶标仪； h) 电子天平； i) 液氮罐； j) 冷冻离心机； k) 96 孔板； l) 细胞培养瓶或细胞培养皿。 4.2.2 试剂和耗材 试验试剂和耗材如下： a) 含 10％新生胎牛血清 DMEM 低糖培养基（含 10％FBS DMEM 低糖培养基）； b) 二甲基亚砜（DMSO）； c) 异丙醇； d) 高密度聚乙烯。 4.2.3 细胞系 L929细胞。 4.3 样品制备 4.3.1 试验样品 准确称取样品溶解在含10％FBS DMEM低糖培养基中，配置成不同梯度浓度的样品，过滤除菌低温保存备用。根据样品现有的细胞毒性数据，配置10个不同梯度浓度的试验样品。 4.3.2 阴性对照 计算直径为1 cm的高密度聚乙烯双面的面积，按3 cm2/mL加入含10％FBS DMEM低糖培养基，37 ℃、120 r/min摇床中浸提24 h，取浸提液使用。 4.3.3 阳性对照 取适量DMSO加入含10％FBS DMEM低糖培养基内，制备10％DMSO溶液，37 ℃、120 r/min摇床中震荡24 h。 4.3.4 空白对照 含10％FBS DMEM低糖培养基，37 ℃、120 r/min摇床中震荡24 h。 4.4 试验方法 按照GB/T 16886.5—2017中附录C规定的MTT细胞毒性试验方法进行，处理条件、检测模型、观察时间按表1进行。试验设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组，试验组，每个试验组设置6个复孔。将复苏好的成纤维细胞传至两代以上呈对数生长期时，按照1×105个/mL密度制备细胞悬液，每孔加入100μL细胞悬液，然后接种到96孔板内，放入二氧化碳细胞培养箱在37℃下培养24 h，移去旧培养基，按照试验设置加入对应培养液，继续培养24 h后，在显微镜下观察每组细胞形态，弃去每组培养液后加入1 mg/mL 50μLMTT溶液，放入细胞培养箱中孵育2 h后弃去孵育液，加入100?L异丙醇，用振荡器上振荡使蓝紫色结晶充分溶解混匀，在酶标仪上检测570nm和650 nm波长的吸光度值并按照式（1）计算细胞存活率。 表1 细胞毒性试验 ??1 =（??570 ???????650 ????）/（??570 ???????650 ????）×100％·····(1) 式中： P1——细胞相对存活率，％； A570 nm——阴性对照组在570nm处的平均吸光度； A650 nm——阴性对照组在650nm处的平均吸光度； B570 nm——阳性对照组在570nm处的平均吸光度； B650 nm——阳性对照组在650nm处的平均吸光度。 4.5 试验用样品浓度的确定 根据细胞毒性试验结果，选择无细胞毒性的高、中、低3个浓度用于细胞增殖和迁移试验。若试验结果的细胞毒性在最高浓度或最低浓度表现为细胞增殖率为最大值，宜进一步增加浓度或降低浓度重新进行细胞毒性试验。 5 细胞增殖试验 5.1 原理 在无血清培养基条件下测定细胞增殖的情况，以无血清培养基为空白对照，含血清培养基为阳性对照。若材料具有促进细胞增殖的作用，则和空白对照相比具有明显细胞增殖反应。 5.2 器具、试剂和耗材、细胞系 5.2.1 器具 同4.2.1。 5.2.2 试剂和耗材 试验试剂和耗材如下： a) 含 10％新生胎牛血清 DMEM 低糖培养基（含 10％FBS DMEM 低糖培养基）； b) 无血清培养基； c) CCK-8 试剂。 5.2.3 细胞系 5.2.3.1 试验可使用的细胞系如下： a) 成纤维细胞； b) 皮肤上皮细胞； c) 食管上皮细胞； d) 胃黏膜上皮细胞； e) 肠黏膜上皮细胞。 5.2.3.2 对于用于不同部位的修复材料选择合适的细胞系，如用于皮肤的修复材料可用皮肤细胞，用 于食管的材料可选择食管上皮细胞。 5.3 样品制备 5.3.1 试验样品 按照细胞毒性试验确认的3个浓度称取样品溶解在无血清培养基中，完全溶解过滤除菌备用。 5.3.2 阳性对照 含10％FBS DMEM低糖培养基，37 ℃、120 r/min摇床中震荡24 h。 5.3.3 空白对照 无血清培养基，37 ℃、120 r/min摇床中震荡24 h。 5.4 试验方法 将在对数生长期内的细胞按照1×105个/mL的细胞密度加入到96孔板内，每孔100 μL，6个复孔。在 细胞培养箱中培养24h后弃去旧培养基，按照表2规定加入对照组和试验组溶液。于24 h、48h和72 h分别观察细胞增殖情况，弃去孔内液体，加入CCK-8溶液，放入培养箱内孵育3h。孵育结束使用酶标仪测量450 nm的吸光度值，按照式（2）计算细胞增殖率，评估试验样品溶液不同浓度对细胞的增殖作用，并筛选出最佳增殖浓度。 表2 细胞增殖试验 ??2 =??450 ????/??450 ????× 100％ ···································································(2) 式中： P2——细胞增殖率，％； A450 nm——阳性对照组不同浓度样品组平均吸光度； B450 nm——空白对照组平均吸光度。 5.5 结果分析 采用统计学方法评价试验结果，并对空白对照组、试验组和/或阳性对照品组各组结果进行综合分 析评估。经统计学分析： a) 在阳性对照和空白对照应有显著性差异（p＜0.05）条件下，试验组和空白对照组比较 p＜0.05，则认为该材料具有促进细胞增殖的效果，否则材料没有促进细胞增殖的作用； b) 若阳性对照和空白对照没有显著性差异（p＞0.05），则试验不成立； c) 若细胞增殖试验表现为增殖抑制作用，该材料可能与培养基中的血清蛋白相互作用，在有血清蛋白存在的情况下可能不会表现出细胞增殖抑制作用，必要时可进一步研究明确其作用机理。 6 细胞迁移试验 6.1 原理 当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个细胞空白区域，即为“划痕”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。通过对不同时期划痕区域细胞状态的观察，对细胞的迁移能力进行判断。该方法模拟了细胞在体内愈合过程中的迁移过程。在细胞单层中创建一个“伤口”，在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像以关闭伤口，以及比较图像以确定细胞迁移速率。 6.2 器具、试剂和耗材、细胞系 6.2.1 器具 试验器具如下： a) 二氧化碳细胞培养箱； b) 恒温水浴摇床； c) 高压蒸汽灭菌锅； d) 倒置荧光显微镜； e) 细胞计数仪； f) 恒温水浴摇床； g) 酶标仪； h) 电子天平； i) 液氮罐； j) 24 孔板； k) 细胞培养瓶或细胞培养皿； l) Image J 图像处理软件。 6.2.2 试剂和耗材 试验试剂和耗材如下： a) 含 10％新生胎牛血清 DMEM 低糖培养基（含 10％FBS DMEM 低糖培养基）； b) 无血清培养基。 6.2.3 细胞系 同5.2.3。 6.3 样品制备 同5.3。 6.4 试验方法 按照表3规定将处于对数生长期的细胞按照1×105个/mL的细胞密度铺于24孔板内，每孔加入1 mL，3个复孔，24h后将一灭菌直尺放置于孔板孔上方，用1 mL枪垂直于孔板和直尺间划一道横线，在10×显微镜下观察，拍摄0 h、以及培养12 h、24 h时的细胞图片，应用Image J按式（3）计算不同时间的细胞迁移率，评估生物材料作用后的对细胞迁移的影响。 表3 细胞迁移试验 ??3 =（??0???12//??24）/S0× 100％·································································(3) 式中： P3——细胞迁移率，％； S0——细胞划痕后0 h细胞未覆盖的区域面积； S12——细胞划痕后12h细胞未覆盖的区域面积； S24——细胞划痕后24h细胞未覆盖的区域面积。 6.5 结果分析 采用统计学方法评价试验结果，并对空白对照组、试验组和/或阳性对照品组各组结果进行综合分析评估。经统计学分析： a) 在阳性对照和空白对照应有显著性差异（p＜0.05）条件下，试验组和空白对照组比较 p＜0.05，则认为该材料具有促进细胞迁移的效果，否则材料没有促进细胞迁移的作用； b) 若阳性对照和空白对照没有显著性差异（p＞0.05），则试验不成立。

Effectiveness evaluation of wound repair materials Part 1:In vitro evaluation method for water soluble materials

T/CSBM 0046-2024 涂层抗凝血性能体外试验方法

5 试验方法 蛋白质吸附测试 5.1.1 概述 当血液与医疗器械接触时，器械表面会迅速的吸附上纤维蛋白原等血浆蛋白，吸附的血浆蛋白会进一步造成血小板的大量黏附，最终导致凝血的形成。因此，评估吸附在器械表面血浆蛋白的吸附情况，可作为判断涂层抗凝性能的重要指标。 5.1.2 方法一 5.1.2.1 原理 通过ELISA间接法，样品表面吸附一定量的纤维蛋白原（Fg）作为抗原，将吸附Fg的样品先与特异性的纤维蛋白原抗体结合，然后加入酶标记的二抗形成复合物，最后通过底物反应产生显色信号来检测样品上吸附的Fg的含量。 5.1.2.2 试验步骤 样品在以pH 7.4的缓冲液配置的Fg溶液中浸泡吸附1 h～4 h后，取出样品轻轻洗去表面未牢固吸附的Fg，置于容器中依次加入纤维蛋白原抗体和带有酶标记的二抗进行结合，然后加入显色剂和终止液，测试反应液在最大吸收波长下的吸光度值，通过与无涂层的同种材料样品比较，间接反映有无涂层样品对Fg吸附量的差异。 注：制备体积较大或较厚的涂层材料时，宜尽量减少切割面的暴露，且使Fg蛋白溶液完全覆盖试验样品。 5.1.3 方法二 5.1.3.1 原理 在碱性环境下，蛋白质分子中肽键与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。二喹啉甲酸（BCA）特异地与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 ?处的吸光度与纤维蛋白原（Fg）浓度呈线性关系，通过建立Fg浓度--吸光度标准曲线，可计算样品表面吸附的蛋白质浓度。 5.1.3.2 试验步骤 5.1.3.2.1 将 Fg 用 pH 7.4 的缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，参照 BCA 蛋白浓度测定试剂盒的要求加入配置好的 BCA 工作液，37 ℃孵育 30 min 后，立即在 562 ?处测试吸光度值，以 Fg 浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，采用线性方程进行拟合。 5.1.3.2.2 样品在 Fg-PBS 溶液浸泡吸附 1 h～4 h 后，取出样品轻轻洗去表面未牢固吸附的 Fg，置于容器中加入 BCA 工作液，37 ℃孵育 30 min 后，立即读取反应液吸光度值，带入标准曲线，计算得到蛋白浓度。通过与无涂层的同种材料样品比较，反映有无涂层样品对 Fg 吸附量的差异。 注1：不同材料会有不同的背景响应值，样品应进行未吸附Fg的测试获取背景数据。例如PVC、镍钛合金和Pebax等 材料采用本方法时背景值较大，在选择方法时宜结合材料特性充分考虑。 注2：制备体积较大或较厚的涂层材料时，宜尽量减少切割面的暴露，且使Fg蛋白溶液完全覆盖试验样品。 5.1.3.3 结果分析 按式（1）计算样品蛋白质的吸附量。 ?? = (??1 ? ??0) × ??······································································(1) 式中： Q——蛋白质吸附量，单位为μg）； c1——样品吸附的蛋白浓度，单位为μg/mL； c0——样品背景的浓度，单位为μg/mL； v——缓冲液体积，单位为mL。 5.1.4 方法三 5.1.4.1 原理 通过痕量标记蛋白的示踪技术来定量分析蛋白在基材表面上的准确吸附量。通过氯化碘（ICl）将125I阴离子氧化成为125I2单质，然后取代蛋白质酪氨酸残基苯环上羟基邻位的氢，从而将125I标记于蛋白质。通过测量吸附在样品表面的放射量来表征蛋白的吸附量。 5.1.4.2 试验步骤 将125I标记后的蛋白质溶液通过阴离子交换树脂柱以除去未反应的125I离子，测定125I标记的蛋白质溶液在280 ?处的吸光值，除以吸光系数后得到标记蛋白溶液的浓度。将标记蛋白溶液按比例与未标记蛋白溶液混合，作为 125I蛋白质吸附液。将待测样品浸入125I蛋白质吸附液中一定时间后，润洗并晾干，使用γ-计数器测定待测样品表面的放射量。同时测定已知蛋白质含量的125I蛋白质吸附液的放射量，从而定量表征样品表面蛋白质的吸附量。 5.2 血小板黏附试验 5.2.1 概述 在凝血形成过程中，血小板的黏附和聚集扮演了重要的角色。黏附在器械表面的血小板活化后会释放大量促凝物质，并发生形态的变化，加速血小板的聚集和活化，从而使凝血反应急剧扩大。因此评估器械表面黏附血小板的形态和数量，可作为判断涂层抗凝性能的重要指标。 5.2.2 试验步骤 样品或对照材料与新鲜的抗凝全血或富血小板血浆（PRP）37 ℃下接触孵育后用生理盐水轻轻洗去表面非黏附的血小板，宜采取包括但不限于以下方法对样品表面黏附的血小板进行观察和分析： a) 样品经乙醇梯度脱水、戊二醛固定、喷金后采用扫描电子显微镜（SEM）观察样品表面血小板的数量、分布和形态； b) 样品经固定、免疫组化染色、晾干后采用荧光显微镜观察样品表面血小板数量和分布； c) 采用细胞裂解液对样品表面黏附的血小板进行裂解，参照市售乳酸脱氢酶（LDH）活性浓度试剂盒的测试方法检测裂解液中 LDH 活性浓度，在样品之间间接比较血小板黏附的数量。 注1：与样品孵育后的全血或PRP也可进行血小板计数，比较样品接触前后的血小板的变化。 注2：宜使用健康成人新鲜血液进行试验，若使用其他动物血液，应验证其适宜性。 注3：宜优先采用与临床场景相似的动态条件进行试验，例如Chandler Loop系统模型。 5.3 凝血时间 5.3.1 概述 本方法适用于带肝素涂层的医疗器械。肝素通过对抗凝血酶的激活阻断凝血反应，导致凝血时间延长。因此，比较样品接触血液后凝血时间的变化，可以反映样品的抗凝效果。 5.3.2 试验步骤 按YY/T 1911方法制备血浆、兔脑磷脂和氯化钙溶液，按GB/T 16886.12的规定制备样品。试验样品和血浆直接接触，依次加入预热的兔脑磷脂和氯化钙溶液后，样品不取出，肉眼观察血浆中出现的冻状凝固物的时间（最长至5 min），用计时器以秒为单位记录。 注：也可使用凝血仪获得凝血时间测试结果。 5.4 体外血栓测试 5.4.1 概述 医疗器械和全血直接接触后会吸附或黏附各类血浆蛋白和血细胞等，激活凝血途径，最终形成血栓。 评估器械和全血接触后表面血栓的形成情况，可以反映样品的抗凝效果。 5.4.2 试验步骤 样品或对照材料与新鲜的全血37 ℃下接触孵育后用生理盐水轻轻涮洗，然后肉眼或显微镜观察器械表面形成的血栓情况，也可称量生成血栓的湿重或干重等指标。 注1：宜使用健康成人新鲜血液进行试验，若使用其他动物血液，应验证其适宜性。全血可使用：非抗凝人体全血、抗凝人体全血、抗凝人体复钙化全血等。 注2：宜优先采用与临床场景相似的动态条件进行试验，例如Chandler Loop系统模型。孵育时长的选择根据样品临床用途和试验目的设定。 6 报告 试验报告应包括但不限于以下内容： a) 样品的识别； b) 样品制备方法； c) 测试方法； d) 测试条件； e) 测试结果。

Testing method for anticoagulation properties of coating in vitro

T/CSBM 0050.4-2024 创面修复材料有效性评价 第4部分：体外微血管形成试验评价方法

5　血管形成试验 5.1原理 人的血管系统负责将营养物质和氧气运送到几乎所有的器官和组织，并将产生的废物通过循环排除体外。血管生成在组织损伤修复中具有很大的作用，血管的缺损会延缓伤口的愈合甚至造成伤口长期不愈。血管新生有利于黏膜损伤后的修复，因此通过EA.HY926细胞探究水凝胶浸提液对于血管形成的影响。 器具、试剂和耗材、细胞系 5.2.1　器具 试验器具如下： a)二氧化碳细胞培养箱； b)恒温水浴摇床； c)高压蒸汽灭菌锅； d)倒置荧光显微镜； e)细胞计数仪； f)恒温水浴摇床； g)酶标仪； h)电子天平； i)液氮罐； j)冷冻离心机； k)T25细胞培养瓶； l)24孔板； m)基质胶； n)Image J图像处理软件。 5.2.2　试剂和耗材 试验试剂和耗材如下 a)MEM低糖培养基：含10％胎牛血清； b)磷酸缓冲液（PBS）； c)0.25％胰蛋白酶。 5.2.3　细胞系 EA.HY926细胞。 5.3样品制备 5.3.1　试验样品 按照4.1、4.2制备。 5.3.2　空白对照 MEM低糖培养基，37?℃、120?r/min摇床中震荡24?h。 5.4试验步骤 5.4.1　EA.HY926细胞培养 5.4.1.1细胞复苏 将EA.HY926细胞冻存管于37?℃恒温水浴锅内不断晃动，待细胞冻存液完全溶解，将冻存的细胞悬液转移至15?mL离心管内，随后加入MEM低糖培养基，用无菌巴氏吸管吹打均匀后1?000?r/min离心3?min。弃去上清液，用MEM低糖培养基重悬细胞，随后将细胞转移至T25的培养瓶中，在37?℃、5％CO2细胞培养箱中培养，24?h后观察细胞状态，并给细胞换液。 5.4.1.2细胞传代 当细胞密度约为80％时，吸去培养瓶中原有的培养基，使用PBS轻洗两次，加入1?mL～2?mL?0.25％胰蛋白酶消化3?min～5?min，显微镜观察细胞消化情况，当细胞边缘缩小，贴壁松动时，手指轻叩细胞瓶身，肉眼可见细胞脱落，向培养瓶内加入一定量的MEM低糖培养基终止消化，MEM低糖培养基与0.25％胰蛋白酶的比例为5：1。终止消化后，用移液枪轻轻吹打细胞层，吹打时宜尽量减少气泡的产生，将细胞层吹落、吹散，然后将细胞悬液转移至离心管内，1?000?r/min离心3?min，弃去原有培养基，加入3?mL～5 ?mLMEM低糖培养基，将细胞重新混悬，取适量混匀的细胞悬液于细胞培养瓶内，在37?℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养。传代比例为1：4，2天～3天传代。 5.4.1.3细胞冻存 细胞消化后，1?000?r/min离心3?min，加入冻存液将细胞混匀，取10?L细胞悬液用细胞计数仪计数，然后将混匀的细胞悬液放入冻存管中，每管1?mL，冻存密度为1×105/mL～1×106/mL。冻存管上应标明冻存细胞的名称、密度、代数以及冻存人和冻存时间。冻存细胞先4?℃放置10?min，再-20?℃放置30?min，然后-80?℃过夜，梯度降温后将细胞转移至液氮中保存。 5.4.2　小管形成试验 小管形成试验步骤如下： a)将基质胶放入冰箱4?℃过夜缓慢融化。枪头、24孔板等放入冰箱-20?℃预冷； b)将基质胶以每孔200?L缓慢加入预冷的24孔板中，避免气泡产生，注意操作过程中手持EP管上方，手心不应接触EP管； c)将铺有基质胶的24孔板放入冰箱4?℃静置15?min，然后转移至37?℃培养箱中静置30?min，使其凝固； d)待细胞融合至80％左右时，将细胞消化、离心并分别用试验液和空白对照液重悬细胞，随后细胞以1×105/mL加入24孔板中，每孔1?mL，3个复孔。放入恒温细胞培养箱中继续培养，分别在3?h、6?h、9?h观察小管形成情况； e)将细胞按照d）步骤铺板，在6?h时将细胞固定免疫荧光染色，显微镜下观察小管形成情况，并拍照，Image J计算成管数量，观察浸提液对血管形成的影响。 6　结果分析 6.1附录A给出了体外微血管形成试验方法的实例。 6.2小管形成试验结果：在观察时间内血管形成情况的描述，并给出显微镜下图片结果。 6.3免疫荧光染色结果：评价血管网形成的数量和血管形成的总长度，采用统计学评价方法，评价材料促进血管形成的效果，并给出免疫荧光染色的结果图片。经统计学分析试验组和空白对照组比较p＜0.05则认为该材料具有促进血管生成的作用，否则材料没有促进血管生成的作用。

Effectiveness evaluation of wound repair materials Part 3:In vitro microangiogenesis evaluation method

T/CIET 482-2024 碳纤维复合材料石墨毡产品技术要求

本文件规定了碳纤维保温软毡及硬质复合毡系列产品的术语和定义、分类和标记、要求、试验方法、检验规则、标签、包装、运输及贮存。 本文件适用于各种工业高温炉的碳纤维软毡及硬质复合保温毡制品。

Technical requirements for carbon fiber composite graphite felt products

T/CIET 479-2024 黏胶基碳纤维复合材料石墨毡制备工艺技术要求

本文件规定了黏胶基碳纤维复合材料石墨毡制备工艺的技术要求，包括原材料要求、生产设备要求、生产环境要求、制备工艺流程、成品检验与试验、运输与贮存、质量保证与控制内容。 本文件适用于黏胶基碳纤维复合材料石墨毡的制备。

Technical requirements for the preparation process of viscose-based carbon fiber composite graphite felt

T/SCSJXH 001-2024 单晶硅PERC太阳电池

本标准的主要技术内容包括：范围，规范性引用文件，术语和定义，缩略语，基本要求，技术要求，试验方法，检验规则，标志、包装、贮存和运输，售后服务。

Monocrystalline silicon PERC solar cells

T/CSTM 00898-2024 甲醛吸附剂用凹凸棒石

本文件规定了甲醛吸附剂用凹凸棒石的术语和定义、要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存。 本文件适用于制备甲醛吸附剂用的凹凸棒石产品。

Attapulgite for formaldehyde adsorbent

T/CSTM 00889-2024 铸造耐火涂层用凹凸棒石

本文件规定了铸造耐火涂层用凹凸棒石的术语和定义、要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输与贮存。 本文件适用于制备铸造耐火涂层用的凹凸棒石产品。

Attapulgite for cast refractory coating

T/CSTM 01214-2024 建筑砖瓦和建筑陶粒生产用尾矿技术要求

本文件规定了建筑砖瓦和建筑陶粒生产用尾矿的术语和定义、要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输、贮存。 本文件适用于生产建筑砖瓦和建筑陶粒用尾矿。

Technical requirements of tailings for building bricks and tiles and building ceramsite production

T/CSTM 01212-2024 抗菌材料用高岭土

本文件规定了抗菌材料用高岭土的术语和定义、要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输与贮存。 本文件适用于抗菌材料生产用高岭土，其它用途高岭土可参照使用。

Kaolin clay for antibacterial materials

T/CSTM 00917-2024 水性结构粘结材料用无机凝胶

本文件规定了水性结构粘结材料用无机凝胶的术语和定义、要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输和贮存。 本文件适用于以天然膨润土为主要原料，经提纯、改性、复合、喷雾干燥等工艺制成的水性结构粘结材料用无机凝胶产品。

Inorganic gel for waterborne structural bonding material

T/CSTM 00696-2024 河湖淤泥制备陶粒污染控制技术规范

本文件规定了河湖淤泥制备烧结陶粒行业在河湖淤泥运输、贮存、预处理和淤泥资源化过程中的污染控制及监测要求。 本文件适用于非危险废物的河湖淤泥制备烧结陶粒在运输、贮存、预处理和资源化过程中的污染控制有关项目的环境影响评价、环境保护设施设计、竣工环境保护验收、排污许可管理、清洁生产审核等。

Technical specifications for pollution control of ceramsite prepared from river and lake silt

T/CIET 379-2024 硅基负极材料

本文件规定了硅基负极材料的术语和定义、分类及代号、技术要求、试验方法、检验规则及包装、标志、运输与储存。 本文件适用于锂离子电池用硅基负极材料。

Silicon-based negative electrode material