干货来袭—— 跟金域学习临床LC-MS/MS方法的开发和验证

　　近年来，质谱技术的快速发展及其高灵敏度、高特异性和高准确度的特点，使得其在临床检验中得到的关注越来越多，应用也越来越广泛。液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）由于其适用分析的化合物范围广泛（极性和非极性化合物），且一次分析可检测多个化合物，获得丰富的化合物结构信息，是目前在临床领域应用最广泛的质谱技术，已广泛应用于遗传代谢病检测、毒理和滥用药物监测、治疗药物监测、类固醇激素检测、营养素检测等多个方面。

　　临床LC-MS/MS检验的对象，均为存在于生物样本（如血浆、血清、全血、尿液、唾液、胆汁、组织等）中的生物标志物，生物样本基质的高度复杂性使得临床LC-MS/MS方法的开发与验证具有其自身的特殊性，那么，如何开发建立稳定的、适用于临床应用的LC-MS/MS方法？金域临床质谱检测中心为大家支招：

　　LC-MS/MS分析方法用于临床常规检验之前，必需进行条件优化和性能验证，分为方法开发和验证两个主要方面。

　　方法开发的过程包括：文献检索、质谱方法建立、液相方法建立和前处理方法建立四大步。

　　第一，文献检索。文献检索过程要解决的问题包括：

• 目标化合物的化学结构信息和理化性质；
• 目标分析物的临床意义；
• 分析物检测所需的生物样本类型（血清、血浆、尿液、全血）；
• 分析物在生物样本中的存在形式及有无其他代谢物、分析物的预期浓度范围；
• 采用LC-MS/MS方法相对于目前现存的其他方法存在的特点；
• 目标分析物检测所需LC-MS/MS的质谱方法、液相色谱方法和前处理方法的概况；
• 准备方法开发所需检测仪器、辅助设备、相关耗材及试剂等。其中，对于分析方法需要关注以下内容：

　　（1）样品前处理方法：样品类型、样品量、处理方法的选择，需要考虑样品处理的效果、试剂、耗材及时间成本；

　　（2）质谱方法： 离子化方式、质量分析器的选择、仪器型号、扫描方式的选择、离子检测通道及相应质谱参数；

　　（3）液相色谱方法：色谱柱的选择、流动相的组成、洗脱方式、进样量。

　　第二，质谱方法建立。质谱方法建立需完成以下步骤：

• 配制纯标准溶液进行质谱扫描，根据目标分析物的极性大小选择合适的离子化方式（ESI、APCI、APPI等），并确定正负离子模式；
• 确定定性定量离子对，在实现分析方法特异性和灵敏度要求的基础上，最好选择两个以上质谱响应高、选择性好、稳定性好的特征碎片离子分别作为定量和定性离子；临床LC-MS/MS方法大多为定量检测，通常采用多反应监测（MRM）或选择性反应监测（SRM）扫描方式；
• 确定合适的离子源参数和扫描参数。

　　第三，建立液相色谱方法建立。液相色谱方法的建立需要考虑以下内容：

• 色谱柱的选择，包括填料类型（非极性固定相C18、C8、C4、苯基柱等，极性固定相氰基、硅胶、氨基等）、色谱柱可耐受PH值范围（分析物的酸碱性质）；
• 流动相的选择，包括流动相的纯度（超纯水、色谱级溶剂）、流动相的种类（甲醇、乙腈、水等）；
• 流动相添加剂的选择，使用挥发性添加剂（甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵等），尽量不要使用不挥发性添加剂（硫酸盐、磷酸盐等），防止影响离子化效率，损坏仪器；
• 洗脱方式的优化，包括采用等度洗脱还是梯度洗脱、起始溶剂的比例、运行时间、柱温、进样体积等；考虑到临床样本基质的复杂性，尽量选择梯度洗脱模式。

　　第四，样品前处理方法建立。生物样本（如血浆、血清、全血、尿液、唾液、胆汁、组织等）基质的高度复杂性使得临床LC/MS/MS方法开发过程中，样品前处理非常重要。样品前处理具有净化样品、提高灵敏度、保护进样系统、延长色谱柱使用寿命、缩短色谱分析过程、提高检测通量等优点。样品前处理方法的建立需要考虑以下内容：

• 常用的生物样品前处理方法有蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取、衍生化、超滤、水解等，需要根据目标分析物的特点和样品类型进行合理选择。
•  一些大型实验室样本量较大，可考虑使用自动化前处理，包括Agilent Bravo系统、Online SPE系统等，以达到提高检测效率，节省成本的目的。但是自动化技术的引进需要考虑到设备的复杂性、成本投入、人员培训和设备维护以及方法开发的难度，结合实验室实际情况决定是否引进自动化前处理设备。

　　临床LC-MS/MS检验方法开发建立之后，用于实际临床检验之前，必须对建立的新方法进行严格、全面的验证，证明其分析性能满足临床诊断的要求。临床LC-MS/MS方法验证的内容包括方法的精密度（批内、批间）、准确度、回收率、分析测量范围、临床可报告范围、分析灵敏度、基质效应、基质特异性、干扰试验、携带效应、生物样品稳定性、前处理后样品稳定性、方法参考区间的建立与验证等，确保可获得准确、可靠、可重复的结果，为临床诊断提供合格的数据。

　　方法验证之后，在日常实际临床检验过程中，需要长期观察监测分析方法的稳定性，包括分析参数如定量定性离子对的比值变化、分析物和内标的保留时间、峰形等，同时需要采用完善的质量控制措施，包括室内质控、室间质评等质量保证措施，确保检测结果的准确性和可靠性。

　　 金域检验临床质谱检测中心 赵蓓蓓

　　2015-11-12