问题：高精度数据，如
orbitrap，在进行SILAC标记定量实验中，如用K4进行标记，会发现K4标记的肽段的鉴定数量要远远小于正常的肽段。
原因：回去查询MS2图谱，会发现，extract.msn这个脚本把K4对应的MS2图谱的前体离子归结到其第一同位素即K0对应的前体离子上，这样，本来应该为K4标记的肽段，却错误的认为是K0的肽段。
这个过程与搜库本身没有关系。K4标记的肽段的y系列离子虽然都是标记的，但是由于MS2是在离子阱内得到，本身的数据精度达不到，所以在搜库是完全可以忽略由于标记带来的质量差别。所以理论上对于K0或者K4对应的肽段的MS2图谱可以认为是相同的，当然这是对于搜库来说。也就是说搜库的结果并不能区别K0与K4，那么是哪一步来确认是K0还是K4呢？
问题就出在extract.msn这一步上，即从raw文件提取MS2图谱这一步上。
首先理一下orbitrap一个ms循环的过程，暂考虑动态排除：
1、在orbitrap中进行高精度的MS1扫描；按照强度对离子进行排序，比如1到10位；
3、比如排位第一的为m/z 500.143的离子，那么在LTQ里面就会在左侧1.5，右侧1.5这个window（具体数值可以设置）内进行母离子的isolation，然后进行CID碰撞断裂，进而得到MS2图谱；这个MS2的图谱在raw文件中记录为500.143@…………，在正常的鉴定中这个过程（上面第三步）一直循环；
4、若上面这个肽段有一个同位素标记的对应的肽段为502.143，也排在了前十位，那么也有机会进行MS2的
分析，这样同样可以得到一样MS2图谱，502.143@…………，
好了，数据已经产生了，本来，上面这两张图谱分别属于两个不同的母离子，但是extract.msn这个脚本却自作聪明，认为502.143@…………这个图谱是的母离子是500.143@…………的母离子的同位素峰，从而认为502.143@…………的最终的母离子也是500.143，因而生成的dta中的母离子信息由502.143被篡改了500.143；
至于extract.msn这个脚本为什么会这么认为无从考证，但是可以肯定的是，脚本在进行上面母离子归结时很可能读过该MS2图谱对应的母离子window内的MS1图谱，同时做了一定的同位素pattern分析，否则也不会做出这样愚蠢的决定,另一种可能性是没有考虑到同位素pattern,认为所有在设定范围内的峰都是同位素峰。
上面说的第三步中应该没有考虑同位素峰的问题，即没有考虑第一同位素与第二同位素高低的关系，而仅仅是按照强度进行的排序。由鉴定结果看，大部分离子都是二价的，考虑到第二同位素问题，isolation window至少应该是前后0.5，前后1比较保险，但是考虑到LTQ的准确度，是前后1.5个m/z（系统默认前后1），从这个意义上讲，虽然理论上上面两个母离子是单独进行分离并分析得到的MS2,实际上被分析的离子可能大部分是相同的，这也是两个MS2图谱几乎相同的原因（除去上面说到的同位素本身对y系列离子的质量在LTQ上的影响较小）。
现在对整个过程应该比较清楚了。
母离子信息的唯一来源就是高精度的MS1图谱，上面说过，extract.msn会分析MS2图谱对应的母离子window内的MS1图谱，比如分析502.143@…………这个MS2图谱时一定分析过至少是包含510这个母离子在内的window的MS1图谱的同位素pattern，遗憾的是，它没有能够准确地做出502.143是一个独立的母离子的判断。当然我们不得不承认这个识别的过程可能是比较复杂，要考虑到一个肽段的同位素峰的强度pattern，500.143这个肽段在502.143一定有一个同位素峰，但是这个强度一定不是现在这独立的肽段的强度。若使用profile模式扫描，各个同位素峰的相对强度值会更准确，会有利于上面的这个识别过程。
说到这里，又看到了一个可能的后果，就是502.143这个位置不是在同位素标记定量实验中的对应的重标肽段，而是在普通的鉴定实验中的一个完全不相干的肽段，extract.msn仍然把他认为是500.143的同位素峰，而且其MS2的母离子仍然认为是500.143，这样就会出现错误的结果。当然，若是存在这样的情况，由于上面降到的isolation window的问题，两个母离子对应的MS2可能也好不到哪里去，因为是两种母离子的混合二级质谱图，这样的图谱搜库本身也是问题，即使分值合格也应该是错误的结果，那么这样是不是也可以作为一个筛选的
标准呢？若能确认一个MS1后的两个不相关的离子靠的很近（如2个m/z以内），且都被鉴定，这样的结果的FPR应该很高。
说了这么多，其实最根本的问题还是同位素pattern识别问题，在以前进行的O18标记定量时就有人曾考虑过这个问题。相信随着质谱精度的提高，以及算法的优化，这也不是个问题了。
当然出现这个问题并不会最终影响定量结果,如果你是用较好的软件进行同位素标记定量的合适处理,只会在鉴定结果上给人假象。
2009-07-03 09:32
