微生物基因组测序的应用

　　一、传染病暴发的时代

　　致死性大肠杆菌传染病在欧洲暴发，至本报道发表前，已导致27人死亡，2800人染病。在拿到明斯特大学医院卫生研究所的研究人员分离的致病株后，Guenther所在的Life Technologie公司德国实验室利用Ion PGM仅用了3天时间就完成了该致病型大肠杆菌菌株的全基因组测序和序列的组装，为快速研究该致病菌株的致病机理创造了条件。与此同时华大基因与德国汉堡-Eppendorf医疗中心合作，也宣布完成了对致病菌株的测序工作。

　　Guenther说： “在有限的时间里完成了对微生物的全基因组测序，极大的方便了研究者从一个整体的水平上去研究微生物，进而揭示在这些目标微生物的基因组究竟发生了哪些改变。”事实上也的确如此，科学家根据从基因组测序的数据所获得的证据，将本次的致病型大肠杆菌鉴定为致病型大肠杆菌的一个新杂交品种，并且携带了一些抗性基因。“从宏观的基因组水平上来研究这类细菌，将在很大程度上革新我们对传染病暴发的认识，3-4天内完成对某种微生物的全基因组测序及基因标注，将会开启一个新的研究领域。”

　　在新奥尔良召开的美国微生物学会年度会议上，一些研究者指出，分子鉴定的方法正被用来打造基因组传染病学这一领域，基因组传染病学致力于重构传染病暴发的过程，以求在将来能够对传染病能进行实时有效的监控和快速反应。

　　二、一个新的领域

　　伯明翰大学的研究者Mark Pallens说：“在过去的18个月，也许就是基因组遗传病学学科诞生的时期。这段时间里在该领域发表的文献至少有十几篇。”最近伴随着基因组测序技术的进步，研究传染病的起源和病原微生物的动态演变将变得极为方便，传统的方法要求将目标序列导入到大肠杆菌中进行分子克隆。现在只要你有序列模板将会有很多种方法获得序列数据”在将来，单分子测序技术将会有更大的突破，基因组遗传病学也可能会跟着兴盛起来。Pallen指出在2001年美国司法部开始调查“炭疽杆菌信件”事件—— 一些政客和媒体收到到含有炭疽杆菌的信——这开启了基因组传染病学研究的先河。在2002年美国联邦调查局与美国基因组研究所合作，将信件中的炭疽杆菌与野生的进行了比对。

　　三、高分辨率的病原菌鉴定与追踪

　　在新一代测序测序技术开始前，许多研究者使用传统的分子分型的方法来研究致病菌种种群的结构及种群的结构的进化。1998年，伦敦帝国理工学院的Brian Spratt与其同事发明了一种叫MLST(多位点序列分型)的方法，Spratt说“这是一项重要的技术发明，我们可以利用该方法来鉴定与人类健康相关的一些微生物，特别是一些传染病源，并探究细菌种群在特定生物地理环境下的演化。”

　　尽管如此，MLST往往不能区分在同一菌种内关系密切的两个菌株之间的差异。Spratt说“其实很多时候我们不能依靠MLST来解决问题，对许多菌种MLST难以奏效。在这个时候我们需要使用全基因组测序来彻底解决问题，即对分离菌株进行全基因组测序。”Sanger研究所的Julian Parkhill 发现对于一种金黄色葡萄球菌分离株，用MLST和一些标准的分子分型方法没有检出显著差异。ASE的Parkhill说：“金黄色葡萄球菌，具有复杂的致病机理，它们拥有一个庞大的族群和丰富的种群多样性，致病性同MLST型很难对应上，二者之间的联系是微妙的。”

　　最近Parkhill对金黄色葡萄球菌ST239的63个分离株进行了全基因组测序，其中20个菌分离自近7个月(来自同一家医院)，其它43株菌来自全世界各地(1982—2003的保存菌)，在这些菌中一共鉴定出6700个SNPs其中有4500个位于金黄色葡萄球菌的核心序列区，值得注意的是这些菌用传统的分型方法不能区分。由此，看出许多表面上相似的菌株，仍然存在着较大的遗传上的差异。通过对这些菌在基因组上的差异进行比较，构建系统发育树，Parkhill小组即可追踪ST239(2002年伦敦大范围传染病的病原菌)在人与人之间，大陆与大陆之间的传播。这一研究结果于2010年1月份发表在《科学》期刊上，文中清楚的阐述了伦敦传染病的病原菌来自于东南亚。Parkhill说：“通过全基因组测序我们可以鉴定出许多潜在的差异位点，进而我们可以追踪病原菌的传播，并将它与人类种群相联系。”

　　四、检测与应对

　　美国食品与药物管理局对沙门氏杆菌的发病率进行评估，发现在美国每年有200-400万人因该菌致病，沙门氏杆菌的发病率正逐步攀升。据FDA相关人员Cao透露，在美国有11%的食物性疾病由该菌引起。为了检测该类传染病，Cao及其同事对各类沙门氏杆菌致病菌株进行了全基因组测序，以求从中找到新的SNPs类靶向位点。

　　最近Cao及其研究组在《新英格兰》医学杂志上报道，他们测序的35株肠道型沙门杆氏菌属.蒙得维的亚血清型，该菌在2009年引发传染病，最先是发现存在于肉类食品生产流程里作为食品添加剂使用的红椒与黑椒中。对研究使用的35株菌：一部分分离自个体生产户生产的食品添加剂，一些分离自食用了该添加剂的感染者，还有一些是取自一定历史时期地理环境中(以此作为背景)。Cao说：“测序技术帮助研究者很快的找到了与病原菌暴发相关的带菌源——一个国内的温室。而应用该技术可以揭示基因型上的微小差异，这对在追踪致病菌在食品上的出现至关重要”。Cao说在将来，FDA打算用全基因组测序的方法做更多的关于传染病的研究，而在2011年他们将对400株沙门杆氏菌进行测序。

　　五、方法上的选择

　　据伯明翰大学的Pallen说：“许多研究者都习惯于采用19世纪的技术来应对来自于21世纪微生物诊断方面问题的挑战。我们的许多工作都有赖于巴斯德时期就发明的显微镜技术和纯培养技术，现在是时候采用新一代的高通量技术来诊断病原微生物了!”

　　因为基因组遗传病学研究将基因组测序数据做为首要的数据源，研究者可以绕开复杂的表型研究与检测，仅仅关注于基因组即可。这是一方法让人难以置信的，但是如果我们回过头来审视过去的三年，也许我们就不会感觉那么诧异了。

　　伦敦的Spratt对基因组流行病学的发展前景持乐观态度，他说：“对微生物菌株进行全基因组测序，获取基因组序列数据，将变成一种习以为常的事情，测序的价格也将趋于合理。它将成为规则的改变者!”

　　基因组网的一个调查：

　　在微生物鉴定方面，全基因组测序能否取代MLST?

　　16% 认可全基因组测序在五到十年内取代MLST

　　54% 认可全基因组测序(WGS)在五年内取代MLST

　　21% 认为可能会，WGS将与MLST互补使用

　　4% 不认为会取代，条件上的限制使WGS 不能取代MLST

　　5% 不认为会取代，对于某些菌种来说MLST要比WGS更为有效