紫外可见分光光度计检测食品中的酶活性

　　酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。

　　为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。

　　紫外-可见分光光度法测定酶活：

　　1. β半乳糖苷酶

　　一β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。

　　【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。

　　【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。

　　2. 超氧化物歧化酶

　　超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。自1969年Mccord等人首次发现了SOD生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。

　　【酶活测定】在25℃ 4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。同时测定Sigma公司的SOD标准品，对所测样品SOD活性进行校正。

　　【酶活定义】在lml反应液中，每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个酶活单位， 即325nm 0.035OD/min为一个酶活单位。

　　3. 多酚氧化酶

　　多酚氧化酶(PPO)是一类由核基因编码在细胞质中合成的含铜质体的金属酶，其作用机理在于铜的氧化-还原作用。大麦中的多酚物质经过PPO的催化氧化后，具有单宁性质，易和蛋白质起交联作用而沉淀出来，进而影响啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性。大麦中部分PPO以“潜伏”状态存在，在浸麦过程中，可通过去除一些酶抑制剂、蛋白酶作用或其他的一些方式使其活性在浸麦过程中提高。在大麦发芽过程中，PPO的活力较高，影响着麦芽的质量。因此，在制麦过程中应该降低PPO活性。

　　【酶活测定】0.1mL酶液与lmL 0.1 mol/L邻苯二酚(用pH 8.4柠檬酸-磷酸缓冲液配制)80oC反应3min，用2mL 20%TCA终止反应，于波长450nm处用分光光度计测定吸收值。

　　【酶活定义】上述条件下，将每分钟OD值增加0.01定义为1个酶活力单位。

　　4.葡萄糖氧化酶

　　上世纪60年代以前，葡萄糖氧化酶主要用于蛋品加工业，除去葡萄糖，防止发生Maillard反应，稳定产品质量，延长保质期。80年代末，又陆续开发了去除啤酒溶解氧和瓶颈氧改善风味延长保质期、果汁果酒除氧护色稳定质量、面粉品质改善、海产品和肉类保鲜、饲料添加去氧平衡畜禽胃肠代谢等用途，并建立了葡萄糖氧化酶专业生产车间。

　　【酶活测定】采用-联(二)茴香胺分光光度法。在有氧存在条件下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在过氧化物酶(POD)作用下，氧供体即邻一联(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色产物。于436nm处测量吸光率的变化，即可换算为葡萄糖氧化酶的活性。

　　【酶活定义】一个酶活性单位定义为在26℃下每分催化释放一微克分子H2O2所需的酶量。

　　5. 果胶酶

　　果胶酶可以改善葡萄酒的色泽、增加酒香，并提高葡萄酒出汁率等，对提高红葡萄酒的品质有重要作用。

　　【酶活测定】向具塞试管中加入1.8mL 0.30% 聚半乳糖醛酸溶液(用0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液配制，调节pH 10.0)，于55℃水浴下保温5 min，然后加入一定稀释倍数的酶液0.2 mL反应15 min，加入DNS试剂1.5 mL，混匀，在沸水中加热10min，立即用自来水冷却，再加入21.5 mL蒸馏水，混匀，于分光光度计上520 nm测定吸光度。空白用煮沸失活的酶液代替。

　　【酶活定义】在上述试验条件下，以每分钟分解底物产生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量为1个酶活力单位。

　　6. 胰α-淀粉酶

　　【酶活测定】用移液管将0.5 mL酶溶液移入试管，并在水浴中调温至25℃。加0.5 mL已同样预热到25℃的1%淀粉溶液。3 min后加1.0 mL DNS显色剂。置试管于沸水中5 min，冷却后用10 mL蒸馏水稀释。用分光光度计于540 nm处以空白作对照测定吸光度。以0.5 mL磷酸盐缓冲液代替酶液测定空白值。

　　7. 植酸酶

　　【酶活测定】 以植酸钠为底物，采用钒钼酸铵法测定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/l的植酸钠(酶作用底物，用0.25 mol/l、pH值5.50醋酸-醋酸钠缓冲液配制)1.0 ml，37 oC预热5 min后，准确加入适当稀释的酶液0.5 ml(对照组先加反应终止液)，37 oC水浴反应30min后，再加入4 ml反应终止液(现用现配)冷却至室温，在415 nm处测定OD值，利用无机磷标准曲线计算出酶活。

　　【酶活定义】在37℃，每分钟从1 mmol/l植酸钠溶液中(用pH值5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制)释放出1 nmol无机磷所需要的酶量为一个酶活单位。

　　8. 羧甲基纤维素酶

　　【酶活测定】在0.5mL适当稀释的酶液中加入质量分数为0.625%的羧甲基纤维素钠溶液，于50℃水浴中保温30min，加2.0 mL质量分数为10%的NaOH溶液终止反应，再加入2.5mLDNS试剂，于沸水浴中煮沸15min，冷却，在550 nm波长处比色，要求光密度读数尽可能在标准曲线的0. 5 mg葡萄糖处。每次测定均设立空白对照，对照管先加入0.5mL酶液，然后加入2. 0 mL质量分数为10%的NaOH溶液将酶灭活，再依次加入质量分数为0.625%的底物2. 0 mL，与待测管一起保温，加入DNS，煮沸、冷却、稀释比色、与标准曲线对照。

　　【酶活定义】在上述条件下，每30min产生0.5mg还原糖为1个Cx活力单位，即每1 h产生1.0mg还原糖为1个Cx活力单位。

　　9. 木聚糖酶

　　木聚糖酶能水解不可溶戊聚糖(阿拉伯木聚糖)，使其成为水溶性的，水解率达65%。面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖，能提高面团的持水性和机械强度，使面团具有更好的持气能力和操作耐力，进而提高馒头和面包的品质。

　　【酶活测定】以木聚糖为底物，用DNS法测定还原糖的生成量。取稀释酶液0.1ml，加1%木聚糖液0.9ml，置50℃水浴保温30min后，加DNS 2ml于沸水浴中显色3min，用自来水冷却后，加蒸馏水定容25ml，测O.D值。

　　【酶活定义】每毫升酶液每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所相当的酶量。

　　10. 蛋白酶

　　【测定原理】中性蛋白酶在一定的温度和pH条件下,水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸,在碱性条件下,将福林试剂还原,生成钼蓝与钨蓝,其颜色深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在660 nm测定其吸光度,可得到酶解产生的酚基氨基酸的量,计算出蛋白酶活力,以此代表蛋白酶的总酶活力。

　　【酶活测定】取3支试管(一支空白管,两支样品管),分别向3支试管中准确加入稀释好的待测酶液1.0 mL,将3支试管放入40℃水浴中预热5 min,同时将测定底物(1%酪素)置同一温度水浴中预热5 min。分别向两只样品管中加入1%酪素溶液1.0 mL,准确计时,反应10 min取出。迅速准确向两只样品管加入0.4 mol/L三乙酸2mL,于空白管中加入0.4 mol/L三乙酸2 mL和1.0 mL 1%酪素溶液,摇匀。3支试管中反应液用滤纸过滤。另取3支试管,分别吸取上述相应滤出液1.0 mL,0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL和稀福林试剂1.0 mL,摇匀,置40℃水浴中放置20 min(显色),取出,迅速冷却置室温。以空白管调仪器零点,在分光光度计波长660 nm处分别测两支样品管吸光度,取平均值。通过查标准曲线求出生成酪氨酸的含量。

　　11. α-淀粉酶

　　α-淀粉酶是第一个应用于面包制作的微生物酶，它取代了麦芽是由于麦芽中的淀粉酶含量不稳定而且含有蛋白水解酶。

　　【酶活测定】在10 mL 试管中依次加入0. 5%可溶性淀粉溶液1 mL , pH 4. 2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2. 5 mL, 40 ℃预热10 min。然后加入多倍稀释的0. 5 mL 酶液, 40 ℃保温5 min后,加入0. 1 mol/L H2 SO4 1 mL 终止反应。再取2 mL 反应液与0. 5% KI - I2 溶液0. 5 mL显色,测定OD620。与淀粉梯度标准曲线对照得反应液淀粉浓度后,计算酶活力。

　　【酶活定义】在pH 4. 2、温度40 ℃下, 5 min水解可溶性淀粉1 mg所需的酶量为一个酶活力单位 。

　　12. 脂肪酶

　　利用脂肪酶作用后释放出的链较短的脂肪酸，增加和改进食品的风味和香味;利用脂肪酶催化的醇解和酯化反应来生产各种香精酯，作调料剂;用有专一性的微生物脂肪酶提高食用油营养价值和增加食用油的花色品种，制备代可可酯等高档油脂;另外，脂肪酶还可以用于酒类的去浊除渣、改善面包质量、改善蛋白的发泡等方面。

　　【酶活定义】在40℃、pH 7.5，以每分钟从橄榄油中释放lμmol脂肪酸的酶量定义为一个酶活力单位。

　　13. 漆酶

　　【酶活测定】3.0mL反应液中含20 mmol/LABTS 0.7mL，酶液0.lmL和25 mmol/L琥珀酸缓冲液(pH4.5)，在25℃下反应2min后立即用冰浴终止反应，测定436nm处吸光度的增量。

　　14. 木质素过氧化物酶

　　【酶活测定】30℃条件下反应体系中含酶液，浓度为0.2mol/L，且pH值为2.4的酒石酸缓冲液及浓度为0.008mol/L的黎芦醇各lmL，加人浓度为0.016mol/L的H2O2 lmL 启动反应，测定反应最初4min内在310nm处的吸光度，以灭过酶活的酶液作对照。

　　15. 锰过氧化物酶

　　【酶活测定】室温下反应体系中含有50mmol/L pH4.5的乳酸钠缓冲液3.4mL，1.6mmol/L的MnSO4溶液0.lrnL，酶液0.4rnL，加人1.6 mmol/L的H2O2 0.lmL启动反应。测定反应最初4min内在240nm处的吸光度。

　　【酶活定义】每分钟使1μmol的Mn2+转化成Mn3+所需要的酶量为一个酶活单位。

　　仪器配置

　　Thermo 公司Genesys系列、Helios系列和Evolution系列紫外-可见分光光度计均可进行食品酶分析。EnzLab软件是Thermo公司研制的专业食品酶分析软件，具有智能提示功能，可以一步步引导操作员完成酶活测定。即使不是酶分析专家，也能获得准确、可靠的数据。而且该软件支持手动输入模式，即使实验室使用的是其它品牌的分光光度计，也能享受EnzLab软件带来的智能和便捷。