荧光法
1.原理
硫胺素在碱性铁青化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。
如样品中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。
本方法的最小检出限为0.05μg。
2.适用范围
GB12390-90 本方法适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响噻嘧色素荧光物质的样品。
3.仪器
3.1电热恒温培养箱
3.2荧光分光光度计
4. 试剂
本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂
4.1 正丁醇：分析纯需经重蒸馏后使用。
4.2 无水硫酸钠：Na2SO4。
4.3 淀粉酶和蛋白酶：国产或进口均可。
4.4 0.1mol/L盐酸：8.5ml浓盐酸(比重1.19或1.20)用水稀释至1000ml。
4.5 0.3mol/L盐酸：25.5ml浓盐酸用水稀释至1000ml。
4.6 2mol/L乙酸钠溶液：164g无水乙酸钠溶于水中稀释至1000ml。
4.7 25%氯化钾溶液：250g氯化钾溶于水中稀释至1000ml。
4.8 25%酸性氯化钾溶液：8.5ml浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000ml。
4.9 15%氢氧化钠溶液：15g氢氧化钠溶于水中稀释至100ml。
4.10 1%铁青化钾溶液：1g铁青化钾溶于水中稀释至100ml，放于棕色瓶内保存。
4.11 碱性铁青化钾溶液：取4ml1%铁青化钾溶液，用15%氢氧化钠溶液稀释至60ml。用时现配，避光使用。
4.12 3%乙酸溶液：30ml冰乙酸用水稀释至1000ml。
4.13
活性人造浮石：称取200g40~60目的人造浮石，以10倍于其容积的3%热乙酸溶液搅洗2次，每次10min;再用5倍于其容积的25%热氯化钾溶液搅洗15min;然后再用3%热乙酸溶液搅洗10min;最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。于蒸馏水中保存。
4.14
0.04%溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL0.1mol/L氢氧化钠研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。
4.15 标准
4.15.1
硫胺素标准贮备液(0.1mg/ml)：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，溶于0.01mol/L盐酸中，并稀释至1000ml。于冰箱中避光保存。
4.15.2 硫胺素标准中间液(10μg/ml)：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释10倍，于冰箱中避光保存。
4.15.3 硫胺素标准工作液(0.1μg/ml)：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍，用时现配。
5.操作步骤
5.1 样品制备
样品采集后用匀浆机打成匀浆于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后混匀使用。干燥样品要将其尽量粉碎后备用。
5.2 提取
5.2.1精确称取一定量试样(估计其硫胺素含量约为10~30μg，一般称取2~10g试样)，置于100ml三角瓶中，加入50ml
0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，放入高压锅中加热水解121℃30min，凉后取出。
5.2.2 用2mol/L乙酸钠调其pH值为4.5(以0.04%溴甲酚绿为外指示剂)。
5.2.3 按每克样品加入20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶。于45~50℃温箱过夜保温(约16h)。
5.2.4 凉至室温，定容至100ml，然后混匀过滤，即为提取液。
5.3 净化
5.3.1用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的三分之一高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。
5.3.2 用移液管加入提取液20~60ml(使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为2~5μg)。
5.3.3 加入约10ml热蒸馏水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。
5.3.4
加入25%酸性氯化钾(温度为90℃左右)20ml，收集此液于25ml刻度试管内，凉至室温，用25%酸性氯化钾定容至25ml，即为样品净化液。
5.3.5 重复上述操作，将20ml硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液，即得到标准净化液。
5.4 氧化
5.4.1 将5ml样品净化液分别加入A、B两个反应瓶。
5.4.2 在避光条件下将3ml
15%氢氧化钠加入反应瓶A，将3ml碱性铁青化钾溶液加入反应瓶B，振摇约15s，然后加入10ml正丁醇;将A、B两个反应瓶同时用力振摇1.5min。
5.4.3 重复上述操作，用标准净化液代替样品净化液。
5.4.4 静置分层后吸去下层碱性溶液，加入2~3g无水硫酸钠使溶液脱水。
5.5 测定
5.5.1荧光测定条件：
激发波长365nm;发射波长435nm;激发波狭缝5nm;发射波狭缝5nm。
5.5.2依次测定下列荧光强度：
a. 样品空白荧光强度(样品反应瓶A);
b. 标准空白荧光强度(标准反应瓶A);
c. 样品荧光强度(样品反应瓶B);
d. 标准荧光强度(标准反应瓶B);
6.计算
c·V V1 1 100
X=(U-Ub)×────×──×──×───
(S-Sb) V2 m 1000
式中：X──样品中硫胺素含量，mg/100g;
U──样品荧光强度;
Ub──样品空白荧光强度;
S──标准荧光强度;
Sb──标准空白荧光强度;
c──硫胺素标准工作液浓度，μg/ml;
V──用于净化的硫胺素标准工作液体积，ml;
V1──样品水解后定容之体积，ml;
V2──样品用于净化的提取液体积，ml;
m──样品质量，g;
100
── ──样品含量由μg/g换算成mg/100g的系数。
1000
例：麸皮2.019g，共有提取液100ml，取20ml经盐基交换管过滤，得提纯液25ml。取5ml提纯液做测定，得出如下结果：
U=52.81 S=45.83 Ub=3.795 Sb=2.692
0.1×20 100 1 100
(52.81-3.795)×------×--×--×--- = 0.56 mg/100g
(45.83-2.692) 20 2.019 1000
7.注意事项
7.1
加热酸性氯化钾而不使其沸的原因是热氯化钾滤速较快，而不沸则是使其不至因过饱和而在洗涤中结晶析出阻塞交换柱。被洗下的硫胺素在酸性氯化钾中极其稳定，可保存一周以上。
7.2
硫胺素在碱性环境中被铁青化钾氧化成噻嘧色素，振摇15s是使其充分反应，这期间应保证黄色不退证明铁青化钾量充足不被其它还原性杂质耗尽，而强碱又可破坏硫胺素，所以除加入碱性铁青化钾时边摇匀边加入外，其加入量一定不能过多，否则硫胺素被破坏。
7.3
步骤5.4.2是整个实验的关键，对每个样品所加试剂的次序、快慢、振摇时间等都必须尽量一致，尤其是用正丁醇提取噻嘧色素时必须保证准确振摇90s。
