MALDI-TOF质谱在肿瘤临床应用的研究进展 (zt)

肿瘤是一种慢性病，是细胞学明显改变的结果，也是人的一种整体性疾病。因而比较复杂，虽然经过长期的研究和实践，对肿瘤的认识取得了很大的进步，但是我们仍然面临着巨大的挑战。对于肿瘤预防的基础认识不够，早期诊断仍很困难，还存在放化疗的敏感性和毒副作用及个体化治疗的不理想，更多因为肿瘤的复发和转移导致治疗的失败等，种种原因使肿瘤的发病率和死亡率没有明显下降。而现有的临床检测手段还不能很好的解决这些问题，因而急需技术的革新。近年来分子诊断学的发展为肿瘤研究和临床应用提供了有利的工具，为肿瘤预防，早期诊断和个体化治疗提供了新的思路和途径。并从不同的分子层次(如DNA，RNA，Pr等)来寻找肿瘤标志物，其中，MALDI-TOF质谱扮演了重要的角色。本文就MALDI-TOF质谱技术平台在肿瘤领域的应用及存在的问题及将来的应用前景作一探讨。

1 基于MALDI-TOF质谱的技术平台

基因序列的变化，基因表达的改变，蛋白结构和功能的变化等与肿瘤的发生发展有密切关系。在后基因组时代，MALDI-TOF质谱对于分析这些分子的变化是非常适合的，能同时在DNA，蛋白，组织等不同层次发挥作用。因而，MALDI- TOF技术在肿瘤临床具有广泛的应用价值，该技术的主要几个技术平台简单介绍如下：

1.1 MALDI-TOF技术在DNA分析领域的应用

MALDI- TOF技术在DNA分析领域的应用平台主要包括SNP，单体图，甲基化，基因表达和突变检测等方面[1-2]。与其它DNA分析技术相比，质谱技术通过直接检测分子量，而不需要荧光或放射性物质。另外，它容易实现高通量，多指标的检测，因而在时间和费用方面都具有很强的竞争力。近年来，质谱技术广泛的应用于DNA分析领域[3]。

1.1.1 MALDI-TOF技术在SNP研究领域的应用

在基因分型方面曾经发明了很多方法[4]，而高通量的MALDI-TOF技术体系被认为是最强大和可靠的[5]。经过十多年的发展，通过单碱基或多碱基扩增终止技术(multiple-base extension with specific termination)，实现了多个SNP的同时检测[6]。Sequenom公司(www.sequenom.com) 利用此技术在SNP分析领域做了大量的工作，他们对10个全基因组进行大规模的SNP扫描，每个基因组检测28000到91000个SNPs不等，此目的是为了发现一些疾病相关的易感基因[7]。目前，MALDI-TOF技术在SNP分析方面扮演着越来越重要的角色。已经商业化的技术有MassARRAY 系统(Sequenom)和GENOLINKTM(Bruker)等。通过质谱技术研究者发现了SEZ6L基因的一个位点多态性(SNP rs663048)与肺癌的发生风险有密切关系[8]。

1.1.2 MALDI-TOF技术在甲基化研究领域的应用

随着人类基因组测序的完成，人们开始关注基因功能和调控的研究。DNA甲基化是基因转录调控的主要机制之一[9]。遗传和表观遗传改变的累积导致了肿瘤的发生，在这系列事件中，表观遗传是比较早期的变化，甲基化往往导致了抑癌基因的失活[10]。另外，甲基化具有肿瘤特异性的模式，其程度往往跟肿瘤的恶性程度有关 [11]。因而，DNA甲基化有可能在肿瘤的分子诊断中发挥作用。

由于在PCR的扩增中，甲基化会丢失，所以在扩增需要固定甲基化状态，使用最广泛的方法是用重亚硫酸盐处理[12]。经过处理后，甲基化了的胞嘧啶在PCR反应中保持不变，而没有甲基化的胞嘧啶就会变成胸腺嘧啶，这样甲基化的分析就变成了C/T SNPs的分析。通过质谱可以准确的对DNA甲基化水平进行定量，Tost J等先用亚硫酸氢盐对基因组DNA进行处理，随后用GOOD方法能有效的分析单个甲基化情况[13]。也可以实现多个甲基化的平行分析[14]。 Ehrich M 等用碱基特异性剪切扩增产物联合MALDI-TOF质谱技术，针对47个基因，对48人份的肺癌和正常组织进行定量的甲基化分析，甲基化的结果与组织病理的结果较为一致[15]。进一步的研究发现其中6个基因的甲基化模式能够区分出非小细胞肺癌，其敏感性和特异性均超过95%，可以作为非细胞肺癌的分子标志[16]。

1.2 MALDI-TOF技术在临床蛋白组学领域的应用

蛋白质作为功能分子，对细胞功能的影响更加直接，将是一种比较理想的肿瘤标志物的分子体现。MADLI-TOF技术在临床蛋白组学的研究也是近10年来的事情，比较明显的进展是Ciphergen的蛋白芯片，Bruker的液体芯片和Intrinsic Bioprobes免疫质谱的发展。

1.2.1 蛋白差异表达检测

在临床蛋白组学领域主要发展了蛋白芯片和磁性微球两项新的分离技术，与MALDI-TOF质谱的联合推出了两个商业化的系统: Ciphergen的蛋白芯片检测系统和Bruker的液体芯片系统，即蛋白质指纹图谱技术。由于其检测材料来源广泛，检测前被测材料不需特别处理，标本加样量少(数微升)，且具有技术操作较简单，可多样本测定，检测快速，灵敏性和特异性高等优点，可用于实验诊断，生物科技，医学等领域[17]。通过标本收集及实验的标准化，蛋白质指纹图谱技术是目前最有希望用于肿瘤早期检测的检测方法之一[18]。根据国内外对12种肿瘤血清及尿液检测结果统计，蛋白质指纹图谱技术检测敏感性和特异性均为80%-90%，明显高于传统肿瘤标志物的检测，所以蛋白指纹图谱技术特别对评估传统肿瘤标记物阴性的恶性肿瘤有意义 [19]。

1.2.2 免疫质谱

质谱与抗体分离技术联合应用即为免疫组质谱(Immunomic mass spectrometry, IMS)，蛋白质功能的改变可能来自以下几方面的原因：编码该蛋白基因的突变，该基因表达量的改变，蛋白后修饰等。而利用免疫组质谱能一次分析实现遗传学，蛋白表达和修饰的统一。也可以同时检测多个生物标志群，是应用于临床检测的理想平台。Ciphergen公司和Bruker公司在这方面都有所发展，而Intrinsic Bioprobes公司自上世纪90年代中以来就专注于免疫质谱的发展[20-21]。 Niederkofler 等人通过免疫质谱实现对血浆中脂蛋白A-I (apoA-I), apoA-II, and apoE的检测，能够快速，准确，灵敏的反映各种脂蛋白的变异情况，从而更加精确的反应分子信息与疾病的关系[22]。 Nedelkov等人用五种多抗(2-microglobulin，cystatin C，retinol-binding protein，transferring，transthyretin)对1000个健康人群的血浆进行研究，发现总共存在27种蛋白形式，大多数因为氧化或单个N端氨基酸丢失，点突变和多碱基缺失只在小部分人群中检测到，其中有两个蛋白修饰与性别有关[23]。

1.3 MALDI-TOF在组织成像领域的研究进展

MALDI- TOF技术直接分析组织能够一次显示500到1000个蛋白信号，它们分子量在2KDa到20KDa上下。近年来该技术也被广泛的应用于组织成像研究 [24-26]。虽然是一项新技术，但是已经用于研究肿瘤临床问题，包括非小细胞肺癌，脑肿瘤等[27-28]。通过研究前列腺癌，发现了PCa-24在肿瘤组织中高表达，其将有可能成为前列腺癌的标志物[29]。一些研究者很好的总结了其实验过程和数据分析及注意事项，包括样本准备，基质选择和使用，MALDI分析前的组织染色，质谱成像和数据分析等 [30-31]。与免疫组化方法相比，质谱成像技术能一次分析很多个分子，且不依赖于抗体，同时能够发现和证明与疾病相关的蛋白。通过与显微切割技术联合应用，研究者可以分析少到10到50个纯化细胞的分子变化情况[32-34]。

2 MALDI-TOF质谱在不同体液中的研究情况

在DNA，蛋白质水平研究肿瘤的发生发展规律，并在病人外周血、尿、痰、唾液、乳头分泌液、脑脊髓液等无创或微创样品中寻找肿瘤特异分子标志已经成为研究热点,以下主要介绍在外周血，痰液等的研究情况。

2.1 外周血

外周血中蕴涵着丰富的疾病分子信息，用来分析的样品主要是血浆或血清。由于血液中蛋白质成分复杂，几个高丰度的蛋白占据了大部分，给分析带来了一定的困难，近年来发展的Ciphergen的蛋白芯片，Bruker的液体芯片技术等是我们大规模分析外周血蛋白的有力工具。但是血液中蛋白容易受各种因素影响 [35]。因而特别强调标准化问题。Banks等[36]用SELDI-TOFMS技术评价了血液处理过程中对小分子量蛋白组的影响因素，结果发现血液的收集和处理过程(凝集管，冻融次数，存放时间和温度等)，芯片类型(H50, CM10, IMAC30-Cu)，抗凝剂种类(EDTA, citrate, heparin)等是主要的影响因素。基于质谱的蛋白质组分析，对于用血清还是血浆的问题有一定的争论。对于小分子量蛋白分析，Tammen等[37]推荐用EDTA或柠檬酸盐抗凝，且去除了血小板后的血浆。也有研究表示用血清优于血浆，认为血清含有很多的信息[38]。至今，这方面的研究已经有很多。大部分的研究通过比较肿瘤患者和健康人群的血清或血浆的蛋白组差异。一些综述很好总结了这个领域的进展[39-41]。

2.2 痰液

通过研究痰液可以发现肺癌相关的肿瘤标志物，特别是鳞癌[42]。有研究报道肺癌的痰检测的敏感性达到65%[43]。Palmisano等[44]发现肺鳞癌患者在临床检出前3年就可以在痰液中发现p16 和 O6-MGMT启动子区的异常甲基化现象。另外，在所有的肺癌类型患者的痰中发现ASC/TMS1蛋白表达降低，痰液中ASC/TMS1基因的超甲基化现象在晚期肺癌患者中普遍存在[45]。这些研究提示通过在痰中检测基因的甲基化情况对于早期发现肺癌有重要意义。

3 基于MALDI-TOF质谱技术的肿瘤标志物的研究思路

生物标志物是指细胞水平，生化水平或分子水平(蛋白，遗传，表观遗传)的改变，能够识别和监测正常，异常细胞或生物学过程。这些标志物可以基于 DNA，RNA，蛋白或抗体等。而肿瘤标志物指示肿瘤存在的物质或过程，可以是肿瘤自身分泌的分子或机体对肿瘤的反应。标志物分析可以通过组织，细胞或体液等介质来检测[46]。如何发现有效的肿瘤标志物，如何把它应用到临床，如何缩短从研究到临床的研发时间等，这些都需要我们在一开始研究时就要仔细考虑。而如何保证标本中的分子信息就是人体内的分子信息，如何保证技术检测到的分子信息就是样本的分子信息，如何保证从技术检测的分子信息中得到有用的信息，如何保证数据分析后得到的信息能应用到临床等，这些都需要考虑标本的收集和处理，实验的标准化和质量控制等。

从基础到临床的转化研究中急需一系列的标准或指南来指导研究，目的是发现真正有用的标志物。研究人员能够完全的报道他们的研究结果，包括阴性结果。要建立统一的指南来发表用于筛查，风险评价，预测和疾病监测的标志物。5条基本原则如下：1;标志物研究和应用必须以病人为中心。2;标志物研究的目标是提高患者的疗效，通过证明那些病人得益于特殊治疗，而另外一些却没有。3;标志物研究要有责任心，资源要共享。4;鼓励研究交流，革新的思路和方法来提高病人生活质量。5;遵守一定的标准和指南来实施研究，报道结果和临床应用[47]。然而，很多标志物在进行严格的评价之前，不适宜在临床的应用。Pepe等[48]建议通过5个步骤来系统的指导肿瘤标志物的研究，这些步骤包括: (1)发现阶段(discovery phase), 如通过比较肿瘤组织和正常组织来发现有差异的分子。 (2) 验证阶段 (validation phase) ，进行临床分析，包括标本的无创收集。(3) 回顾性研究, 评价标志物对于发现临床前疾病的能力，要大样本的收集健康人群并跟踪直到疾病发生。(4)对无症状或高危人群的筛查与跟踪,评价所选标志物在早期发现肿瘤的能力。 (5)通过大规模的人群筛查能否降低发病率和死亡率。对于有用的标志物，分析方法要有统一标准，这样的检测结果能够被医务人员准确的利用。高质量的临床标本和详细的准确的临床信息要相配套，标志物通过验证后，继续收集临床数据以提高我们对长期效果的了解和后续的研究。一开始就要有效的设计和系统来保证有效的发现标志物。

4 展望

很难通过单一的标志物达到理想的目的，因为人的年龄，性别，饮食，遗传等因素都不相同，还有肿瘤的异质性问题。因而需要多个标志物的联合检测。而如何找到有联系的多个标志物组合是我们努力的目标。总得来讲是技术平台(MALDI-TOF质谱技术)，标本类型(外周血，痰液等)，要解决的问题(风险预测，早期诊断，疗效预测，监测，预后等)，目标分子和层次(SNP，甲基化，基因表达，蛋白，组织成像等)和数据处理的有机统一。通过结合标本库和信息库，来理解各分子间与肿瘤的有机联系。对于健康人群，高危人群和肿瘤患者要建立各自的分子信息库，对于个人要动态监控，建立个人的分子信息库。

由于MALDI-TOF质谱技术可以应用于DNA，蛋白，组织等不同平台分析，而且具有多指标平衡检测能力。另外，MALDI-TOF质谱技术也是一种无标记的检测技术，从而可以降低检测成本，又具有高灵敏度和高通量的检测能力等，因而该技术是肿瘤标志物应用于临床的理想平台。必将在肿瘤筛查，早期诊断，个体化治疗等领域发挥重要的作用。

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