MALDI-TOF仪器采购浅谈

前言

自从基质辅助激光解吸附离子化（MALDI）技术问世以来，已经有近二十年的时间了，并且，如果把引用率作为唯一参考的话，那么这种技术的发展目前还看不出有任何放缓的趋势；根据PubMed显示，1990年到1999年涉及MALDI的引用次数为2,096次，而从2000年到现在，引用次数则已达到了11,117次。

在MALDI技术中，样品（譬如多肽、寡核苷酸或整蛋白的混合物）与基质材料（诸如2,5-二羟基苯甲酸或alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid）混合，然后被点样到一块金属的靶板上，并干燥。当采用激光对样品进行激发时，基质迅速吸热，从而导致样品离子化，其电荷数通常为+1。这些离子经质量分析器解析，通常采用飞行时间（TOF）分析器，即基于离子到达检测器的时间来确定离子的质量。

应 用

与其他方法相比，MALDI（以及它的姊妹“软电离”技术，电喷雾离子化）的优势在于它可以对生物样品（诸如：蛋白、多肽、多糖和寡核苷酸）进行非破坏电离。当其与具有充分精度的质量分析器联用时，基于MALDI的仪器即可通过获得肽质量指纹图谱来进行蛋白鉴定。而如果是串联配置（TOF/TOF），MALDI仪器还可以提供蛋白序列数据。总之，MALDI质谱仪已成为了蛋白质组学市场的go-to技术。

按照Applied Biosystems生物标记和蛋白质组学事业部产品市场经理Dominic Gostick的说法，尽管MALDI经常被选择作为经一维和二维聚丙烯酰胺凝胶处理后的蛋白鉴定工具，但它同时也是传统的基于ESI的液相色谱工作流的补充，在这方面，MALDI主要是用来分析色谱的流出组分。

“就LC-MALDI质谱仪而言，确实是有一些优势的”，他认为“如果把LC与分析器分离，那么确实可以在洗脱液中使用三氟乙酸，从而得到更加尖锐的色谱峰，但这样一来就无法与电喷雾离子化兼容了。再者，把单级MS从串联MS/MS中分离，那么对于更深入地挖掘，譬如试图观测每一个样品中最大数目的多肽还是具有一个明显优势的。”

这是因为，质谱分析与液相色谱分离意味着我们将不再局限于在下一个色谱峰流出之前所获得的有限信息。

Waters Corporation质谱产品经理Ronan O’Malley也认为，MALDI-TOF质谱仪的价值已超越了蛋白生物化学实验室。“在蛋白质组学领域，MALDI-TOF确实十分重要，因为没有其他可替代的方法。不过，这项技术对于寡核苷酸工作同样具有重要意义，譬如在质量控制方面，此外，对于多糖的鉴定和结构解析，该技术同样不可或缺。”

在其他的应用方面，包括基因分型和MALDI成像，作为一种分析手段，一个组织样品中的蛋白或代谢组分的鉴定是通过一束激光扫描样品的光栅化处理完成的，这一点与点阵式激光打印机很相似：即从左到右，从上到下。


单级还是串联

也许用户在采购一台MALDI-TOF时，需要做出的最大决定就是是否需要串联式（也就式TOF/TOF）的仪器。

就串联质谱仪而言，可以选择一个具有特定质量的母离子（也就是分析的第一阶段），然后再将其打碎。它的子离子再被进行第二次质量分析（也就是串联部分），从获得的数据中可以揭示分子的结构或序列；而单级TOF仪器则缺乏这种能力（尽管在离子的飞行过程中，由于“后离子源衰减”确实会产生一些碎片）。

尽管对于获得肽质量指纹图谱而言，单级的MALDI通常是足够用了，但如果涉及到测序或结构鉴定，不同形式的串联能力就是必不可少的了。Gostick表示，在过去的几年当中，随着用户需求的日益复杂，他亲眼目睹了相关产品销售趋势的变迁。

“当单级MALDI-TOF质谱仪第一次出现在蛋白质组学市场，大部分科研人员鉴别蛋白的方法仅仅是利用经胰蛋白酶分解后的多肽质量，很自然，我们看到了单级仪器销售的飞速增长，这种增长同时也带动了二维凝胶产品的相关市场。” Gostick进一步阐述，“但是，当我仔细审视过去几年中用户的购买倾向后发现，他们已越来越不满足于只购买一台单级的MALDI仪器。除了可以获得精确的分子量外，他们希望仪器还可以提供更多的功能。”

Applied Biosystems可以提供单级和串联的仪器，包括单级的Voyager质谱仪（DE-PRO和DE-STR）和4800 MALDI TOF/TOF分析仪。Bruker Daltonics的Ultraflex Ⅲ也采用了串联TOF的配置。

还有一些公司提供的串联MALDI仪器则是基于一种混合质量分析器的配置。譬如Applied Biosystems的QSTAR，MALDI源可以作为一个选件配置在四极杆—飞行时间质量分析器上，类似的情况还包括Waters Corporation的MALDI Q-Tof Premier。


直线还是反射式

采购MALDI-TOF质量分析器时，有两种主要的配置可供选择：单一直线式，或在飞行管的末端增加一个离子反射器。就单一直线式TOF仪器而言，某些质量相同的离子有时在飞行管中飞行时，其动态能量只有细微的差别，这种情况下，它们达到检测器的时间也就几乎相同。而造成的结果就是峰宽变宽，质量准确度和分辨率下降。“反射式”其实是通过一种离子镜或反射器，让通过飞行管的离子束反弹回去，再被与离子源相邻的检测器接收，也就是对质量相同的离子起到聚焦能量的作用，从而提高分辨率和准确度。

根据Bruker Daltonics销售和市场部助理副总裁Victor Fursey的看法，从离子分离的角度，反射式提供了“一种双重夹击”，也就是同时提供了能量补偿和相对于直线模式而言更长的飞行路线。不过他在随后的补充中也承认，直线式仪器依然会在实验室中占有一席之地。对于基本的质量控制工作而言，它是一种非常好的分析手段，此外，对于观测非常大的离子，譬如大的整蛋白，直线式是必不可少的，他表示，“一旦你试图折返离子或用正交方式进行离子分离，那么离子光学系统处理那些具有相当高荷质比的碎片将会变得非常困难。”

尽管目前大多数MALDI-TOF质谱仪均包括直线和反射式两种检测器，但并不绝对。譬如，Bruker Daltonics的microflex LT就只提供直线式配置。


轴向或正交

基于MALDI技术的质谱仪又可以根据其飞行管的几何构形进一步细分为轴向和正交型仪器。

就轴向型仪器而言，被激光激发的离子在飞行管中是沿着直线飞行（也就是轴向飞行）；而在正交系统中，相对于最初的离子飞行路线，飞行管则被旋转了90°。

Gostick表示，正交型的优势在于它使检测器和离子源分离开来——或者用更加准确的说法，就是不会影响样品靶位置的多样化。“不过，在我们的4800上，现在有一种96孔板的尺寸，对于要保持一个全范围内不变的质量准确度而言，那确实是一个很大的尺寸，”他认为，“稍有误差就会导致质量准确度的漂移。”O’Malley的看法是，由于组织厚度的差异，MALDI成像同样也面临着样品靶位置的挑战。

O’Malley认为，“正交型系统测量的是从离子推动器到检测器之间的飞行时间。”“你不必再考虑从离子源开始的飞行时间，这样一来，在离子源的任何能量扩散就不会对分辨率以及质量测量产生不利的影响。”其结果是，正交型系统（诸如Waters的MALDI Q-Tof Premier和Perkin Elmer的单级PrOTOF 2000）较之轴向型系统可以提供“在整个质量范围内的稳定的分辨率，更出色的质量准确度以及更好的长期校正稳定性。”


软件

没有高质量的软件对数据进行分析，那么全球所有的质谱数据都将毫无意义。Gostick认为，“MALDI-TOF的典型目标客户，他们与生物的联系应该较之与质谱的联系更加紧密。”这就意味着软件应当使得复杂的工作流程容易为那些质谱可能并非是其第二专业的人员所理解。“他们需要的是相对而言易于使用的工具。”

Applied Biosystems最近推出了用于蛋白定量和定性的全新软件——ProteinPilot。Gostick介绍道，“我们为软件增加了一些运算法则从而使其更易使用，现在我们寻求关于生物问题的答案，可以让软件做出硬判决，而无需再由使用者做出。”

Temple大学Fels研究所的蛋白质组学核心小组的主管Salim Merali表示，其最新的Bruker AutoFlex Ⅱ TOF/TOF所配置的软件是他喜欢这一系统的原因之一。Merali认为，“它的用户界面更加友好，使用者可以与仪器直接互动，可以在屏幕上完成对系统的操作，这一点是非常具有吸引力的，简便，‘傻瓜’，而我们实验室的其他仪器就略微显得有些笨拙了。”

O’Malley的看法是，在购买仪器进行决策时，其他一些需要考虑的可变因素还包括通常的一些质谱参数——质量准确性，分辨率和专属性——还有像母离子分辨率和离子碎裂方式等。

最后，Gostick总结认为，考虑要长远。不能仅仅因为这种仪器是蛋白质组学工作流程中承担高通量分析工作的工具，就认为其他用户在其他应用领域（譬如分析寡核苷酸或糖类）会无所作为。“一般而言，人们采购这种仪器是作为高通量分析工具，但有时候他们也会希望有一些灵活性，因此在采购仪器时他们也会关注一些其他因素。”


实地考察

Vanderbilt大学质谱研究中心的助理教授Shannon Cornett在为其所在的研究小组采购MALDI-TOF仪器前，花了两年时间走访了Bruker Daltonics和Applied Biosystems。

“对于我们而言，关键的因素是在整个质量范围内（最高到100,000分子量左右）的灵敏度，”Cornett主要从事对于病变组织样品的MALDI成像。他把来自于“同一个生物组织”的样品同时送往两个公司，然后将它们的分析结果与他利用自己实验室已有仪器所得的分析结果进行比较。

    在对任何一个质谱厂家做出购买承诺之前，如果可能，你最好能充分利用它们的演示机构，充分利用它们的演示仪器。