实时荧光QPCR科普问答

上一篇 / 下一篇  2009-09-04 14:47:26

问:什么是QPCR?

答:QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统,简称QPCR。


问:QPCR、DNA检测、PCR之间的关系?

答:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction简称PCR)原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获93年诺贝尔化学奖。因其在病原体检测方面的独特优势,因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快,成为分子生物学诊断的主流,至今仍处于学术和应用前沿:

第一代产品:

基因扩增热循环仪(DNA Thermal Cycler)+电泳仪+紫外分析仪+定性试剂,构成PCR定性检测。

第二代产品:

基因扩增热循环仪+荧光仪+终点定量试剂,构成PCR-DNA终点法定量检测(End-point quantitative PCR detection),又分为终点酶免定量( End-point ELISA-PCR)和终点荧光定量(End-point Fluor-PCR)两种。

第三代产品:

实时定量QPCR仪+实时荧光定量试剂,构成QPCR-DAN/RNA实时荧光定量检测。


问:相比以前的方法,QPCR有哪些特点?

答:QPCR至少有以下特点:

  • 所用仪器少,只用一台仪器。
  • 检测时间短,只须45分钟~1小时10分钟(试剂各异),而定性PCR须3~4小时,酶免终点定量须5~6小时,荧光终点定量须2~3小时。
  • 操作极其简单:前处理后,样本插入仪器一小时后到电脑上来出报告即可,无须开盖,移样本(以前方法),避免污染
  • 结果精确:定性PCR只能定性,很粗略,终点定量PCR由于只能在40个热循环结束后检测荧光,被测荧光达到饱和导致定量不够精确,属于半定量状态。而实时荧光QPCR是在扩增的每时每刻连续检测各样本的荧光值的变化。

问:QPCR的技术先进性、价格及应用现状?

答:实时荧光QPCR是当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术,被美国FDA承认并推崇,被美国FDA批准并取得临床应用执照的QPCR试剂品种有:

  • HBV乙肝病毒DNA,
  • HCV丙肝病毒RNA,
  • HIV爱滋病病毒RNA,
  • Chlamydi trachomatis(CT),性传播疾病,沙眼衣原体,
  • Neiserria gonorrhea (NG),性传播疾病,淋病双球菌,
  • Cytomegalovirus(CMV),性传播疾病,巨细胞病毒
  • Mybobacterium tuberculosis(Mtb),呼吸道疾病,结核分支杆菌等。

实时荧光PCR仪研发技术难度大,门槛高,发达国家也只有有限几家知名公司生产,且售价昂贵:如

  • 罗氏公司 LightCycler 480
  • 德国eppendorf 公司 Mastercycler ep realplex 实时荧光定量PCR仪
  • BIO-RAD公司 iQ5实时PCR检测系统
  • 美国ABI 7500 Real-Time PCR System
  • 美国ABI 7000 Sequence Detection System Spare Parts
  • 美国ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System

以上产品价格在50万上下不等

可见,在病人看来,哪家医院应用了QPCR技术便是先进诊断技术的象征,在发达国家也是如此。

国产仪器情况:国产仪器生产单位不超过五家,其中包括:

  • 日本独资杭州博日实时荧光QPCR仪(33孔)
  • 西安天隆科技有限公司实时荧光QPCR仪(48孔)
以上产品均取得国家SFDA认证,报价均在30万以内

国产试剂情况:

多家公司生产实时荧光QPCR试剂盒,价格与终点法试剂相当,且品种齐全,价格便宜,购买方便:

  • 乙肝HBV-DNA,
  • 丙肝HCV-RNA,
  • 艾滋AIDS HIV-RNA,
  • 性病系列:淋病双球菌NG, 沙眼衣原体CT,
  • 解脲支原体UU, 疱疹病毒HSV,
  • 人体乳头瘤HPV,
  • 优生优育系列:巨细胞病毒CMV,弓形虫COX等。

问:QPCR的应用领域

答:QPCR主要应用在医疗检验、疾病防控、食品安全、农业、林业、畜牧养殖、水产养殖、分子生物、法医鉴定、科研探究等诸多领域。

据不完全统计相关国家标准强制要用QPCR仪进行检测:

《2004GB/T 194380.1-禽流感病毒通用荧光 RT-PCR检测方法》

《SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法:荧光PCR方法》

《SN/T 1870-2007 食品中致病菌检测方法:实时PCR法》

《GBT 21105-2007 动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法 PCR方方法》

《GBT 21102-2007 动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法 实时荧光PCR方法》

《GBT 19915.8-2005 猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测方法》

《GBT 19495.4-2004 转基因产品检测 核酸定性PCR检测方法》

《SNT 1686-2005 新城疫病毒中强毒株检测方法 荧光RT-PCR法》

《SN 0169-1992 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》


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分析测试 引用 删除 yq2009   /   2009-09-15 02:20:52
这些资料很好。
sseia42 引用 删除 sseia42   /   2009-09-11 15:01:22
原帖由358uwcj于2009-09-07 13:02:08发表
难得有对 实时荧光QPCR 如此清晰地总结,
真是谢谢了
TTEWEE 引用 删除 TTEWEE   /   2009-09-09 11:37:38
感谢博主提供的资料!
woaifou 引用 删除 woaifou   /   2009-09-09 10:12:10
3
swn_nyve_vb 引用 删除 swn_nyve_vb   /   2009-09-08 15:08:52
总结得不错,关注啦!
aasle 引用 删除 aasle   /   2009-09-08 15:01:08
不错,分享了。
358uwcj 引用 删除 358uwcj   /   2009-09-07 13:02:08
难得有对 实时荧光QPCR 如此清晰地总结,
真是谢谢了
 

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