液相色谱质谱联用仪新型高通量前端系统

上一篇 / 下一篇  2010-03-05 12:46:39/ 个人分类:有机样品前处理

  质谱( MS )技术应用于药物发现已有数十年。从以往来看,仪器产生的数据大大超过软件处理的能力。近年来,软件的速度和分析能力大大提高,促使仪器制造商转向提高系统的效率和通量。这大大提高了质谱前面分离技术的革新,比如从液相色谱发展到高压液相色谱以及超高压液相色谱。

  最进前端技术的发展侧重于提高质谱的效率,一般是提高进样速度和质谱分析速度。如最近开发的多维液相色谱技术(LC)和激光二极管热解析技术( LDTD ),二者都是通过增加质谱仪有效检测数据的时间,并最大限度减少其空闲时间,从而达到提高效率的目的。

  为实验室选择最佳的高通量技术需要认真考虑对通量的要求以及技术的特点。当评估多维液相色谱和激光二极管热解析时,科学家至少应考虑三个主要问题:速度,灵敏度和系统易优化性。本文介绍了两种技术的基本原则,并比较他们在两个共同的药物发现应用中的性能。

  前端可替代技术

  多维液相色谱

  多维液相色谱系统是使用多于一个的高效液相色谱将样品注射到单一的质谱仪,使其提高通量。每个通道可以独立操作,用户在所有四个通道可以同时运行相同的方法,或者每个通道都有不同的方法。双通道系统的通量是单液相色谱通量的一倍,而一个四通道系统的通量是其四倍,将质谱的空闲时间从百分之七十五减至百分之四。多维液相色谱系统最大程度地利用质谱仪,使质谱几乎没有空闲时间。

  多维液相色谱技术有很多优点。最重要的是没有通过牺牲色谱分离而提高了样品的通量。因为每一路的液相色谱的操作是分开和平行的,在整个洗脱步骤中,质谱是对单个样品进行分析,在整个过程中保持数据质量和灵敏度。软件可以控制泵的操作,阀切换,清洗和梯度程序。

  此外,每组样品的分析都是在单一液相色谱系统中运行。标准样品,质控样品和待研究样品的分析都是在同一个硬件上完成。与一台通过阀切换的液相色谱质谱没本质区别。只要实验设计合理,多维液相色谱系统的日内和日间精密度和准确度都可以满足LC-MS/MS的公认标准。

  激光二极管热解析

  激光二极管热解析与液相色谱是根本不同的,因为它不需要液相。激光二极管热解析是将2-10µL的样品注入到96孔板中。每一个孔底部植入一块金属。将该盘室温干燥。用激光二极管加热孔,使干燥的样品迅速产生热解析。完整的热解析分子被载气带入到大气压化学电离区域进行离子化。大气压化学电离不需要溶剂或流动相就可以完成,这改变了离子化的特征,可以分析那些在普通大气压化学电离不能有效离子化的化合物。

  热解吸能产生完整的解吸附分子,温度低于熔点。激光二极管热解析的性能源于高的加热速率,载气流量以及高灵敏度

  激光二极管热解析消除了样品交叉污染的风险,不需使用色谱技术如高效液相色谱。此外,它还没有由流动相引起的背景噪音,或基质效应(如MALDI),而且样品制备也非常简单,每孔只需要2-10µL样品然后进行快速溶剂蒸发。而且不需要在样品中添加任何的基质.

  比较

  选择一个高通量的前端系统很大程度上取决于三个重要变量:速度,灵敏度,易优化特点。因为激光二极管热解析不需要物理化学分离,所以它比多维液相要快但不灵敏。激光二极管热解析处理一个样品需要7-8秒。而多维液相色谱系统需要25秒。对于许多用户,这个微不足道的差异可以忽略不计,在1分钟以内都是可以接受的。

  虽然激光二极管热解析方法提供更快的速度,但是没有物理分离有一个缺点:低灵敏度。例如睾丸酮4-羟基代谢产物和6-羟基代谢产物有同样的分子量。当用液相色谱时它们只是物理分离,两个峰有不同的保留时间,使得他们可以清晰的区分开并且实现定量。用激光二极管热解析进行同样的实验时,4-羟基代谢产物和6-羟基代谢产物同时洗脱下来(同时解吸附),不可能对每个代谢物实现单独定量。

  系统易优化的特性是多维液相色谱和激光二极管热解析又一个不同。系统优化实际上是为了确定理想参数的一个过程。例如对于一个质谱实验来说,有必要优化S透镜电压,碰撞能量,和前体离子和产物离子的分子量。

  当前端采用多维液相色谱,可用注入模式优化质谱的参数。将化合物以一定速率和浓度泵入质谱中,软件会自动改变质谱参数,监控结果,自动找到最优的设置。

  当前端采用激光二极管热解析,可采用环注射优化获得最佳质谱参数。由于热解吸没有提供一个统一的样品浓度,用软件自动优化时是很困难的。在环注射优化模式下,当样品浓度和质谱参数同时改变的时候,很难确定绝对好的参数。

  显然,多维液相色谱和激光二极管热解析都是不错的分析方法。哪一个更适合这个问题取决于是实验室的需求:是追求更快的速度还是追求更好的灵敏度?

  应用

  早期评估候选药物的吸收,分布,代谢和排泄( ADME )是药物发现的一个必不可少的组成部分。 ADME特征可帮助识别人体药物代谢动力学好的一面和坏的一面。采用两种常见的实验-细胞色素P450和代谢稳定性-比较多维液相色谱和激光二极管热解析两种方法。

  在药物发现的过程中关键一步是鉴别可能的药物药物相互作用。主要原因在于这些相互作用的药物会与细胞色素P450的同功酶发生竞争抑制,这通常用细胞色素P450的抑制方法来检测。细胞色素P450的检测方法非常易懂且已标准化,一旦优化好检测细胞色素P450的探针化合物的质谱参数,就可以很方便的检测。一次优化针对一个探针化合物,一旦优化好,则不需要更改参数。化合物浓度通常在治疗水平。代谢物的浓度非常低,因此需要高灵敏度地方法来进行检测

  代谢稳定性试验是研究随着时间的推移化合物的代谢,以确定该化合物的体外半衰期。在该方法中化合物的浓度比细胞色素P450浓度要高得多;因此,对灵敏度的要求不是特别大。然而,在一天内需要对多个化合物进行测试,因此每一个都需要优化,因此易优化的特性是非常重要的。

  激光二极管热解析在细胞色素P450的应用

  在最近的一次应用LDTD技术检测通量能力的实验中,研究人员用Phytronix Technologies 公司的LDTD源耦合Thermo Scientific三重四级杆质谱仪进行检测。研究者观察到8个代谢物。对9个抑制剂浓度进行了测试,在每一个抑制剂浓度下检测形成的代谢产物。计算了酶活性并绘制成图。在8个代谢物中,其中有一个由于发生源内裂解没有鉴定到。在进行LDTD™实验中,所有9个异构体都放入到同一个样品中,样品检测时间为15秒。

  在液相色谱-串联质谱中同样进行细胞色素抑制试验,该系统有一个标准、非多维的液相色谱耦合应用生物系统的API4000离子源。样品根据不同的亲油性分为3组。样品检测时间为6分钟。

  研究人员发现,两种方法的数据是有可比性的,而且用LDTD系统检测混合样品可以减少时间并节省成本。由于样品检测的速度大约为15秒,,因此完成96孔板的所有样品检测也只需要24分钟。由于可能的源内裂解,非那西丁形成对乙酰氨基酚,研究人员得出结论,液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)有更大的选择性。

  代谢稳定性研究:高效液相色谱和多维高效液相色谱

  代谢稳定性的定义是母体化合物的百分比在代谢活性测试系统随时间推移丢失的量。对于代谢稳定实验,典型的测试系统是肝微粒体,肝S9,肝细胞(贴壁或悬浮),一般根据实验目标不同选择不同的测试系统。

  为了确定一个新化学实体的代谢稳定性,需要对孵育上清中的候选药物进行定量,这项工作通常是由高效液相色谱质谱完成。通过了解化合物的代谢稳定性,可以对化合物进行排序,可以使候选药物由于药动原因失败的几率大大降低。

  最近的一项研究表明,当进行代谢稳定实验的时候,通过自动优化和多维液相色谱,通量可以显著提高。Thermo Scientific Aria TLX-4液相色谱系统,Thermo Scientific QuickQuan 自动优化软件,在加上TSQ Quantum Ultra™三重四级杆质谱仪可以现在鉴定优化时间,并提高样品通量,而不牺牲谱图质量。

  对8个化合物分别用自动优化和手动优化进行比较,一维液相色谱和多维液相色谱进行比较。采用单高效液相色谱质谱系统和手动优化模式分析样品;采用四通道多维液相色谱质谱系统和自动优化模式分析样品。二者的准确度与理论值相比小于10%,精密度RSD<10%。

  采用手动优化的模式大约花了2个小时,平均15分钟一个化合物。而自动优化总共才花了16分钟,平均2分钟一个化合物。提高了7倍的时间。在单通道液相色谱系统中运行时间需要48个小时。而在四通道多维液相色谱系统只需要12个小时。运行时间提高了4倍。研究者得出结论。自动优化和多维高效液相色谱系统能够显著提高通量,而不损失数据质量。

  结论

  LDTD和多维液相色谱在药物发现的实验中都能提高通量。多维液相色谱提供更高的灵敏度(如细胞色素P450),并且易于优化,对于每天分析多个样品是很实用的。LDTD能够提供高通量,可以使用户在一天内分析更多的样品,而且可以快速得到结果。然而,自动优化不是很准确。实验室必须根据对速度、灵敏度和易用性的要求进行评估。

  参考文献

  (1) Wernevik, J.; Landin, A.; Tremblay, P. LDTD-MS/MS and LC-MS/MS comparison for high throughput IC50 determination of CYP2A6, 2B6, 2C9, 2C19, 2D6 and 3A4 inhibition in Human Liver Microsomes (HLM). 28th Montreux Symposium on LC/MS, Montreux, Switzerland, Nov. 12-14, 2008.

  (2) Yan, Z., Caldwell, G. Evaluation of Cytochrome P450 Inhibition in Human Liver Microsomes. In Methods in Pharmacology and Toxicology, Optimization in Drug Discovery: In Vitro Methods; Yan, Z., Caldwell, G. Eds.; Humana Press Inc.: Totowa, NJ, 2004; pp 231.

  (3) Ackley, D.; Rockich, K.; Baker, T. Metabolic Stability Assessed by Liver Microsomes and Hepatocytes. In Methods in Pharmacology and Toxicology, Optimization in Drug Discovery: In Vitro Methods; Yan, Z., Caldwell, G. Eds.; Humana Press Inc.: Totowa, NJ, 2004; pp 151.

  (4) Berube, M. High Throughput LC-MS/MS Analysis of Metabolic Stability Incubations, Application Note 458; Thermo Fisher Scientific: Franklin, MA, April 2009.

  TSQ Quantum Ultra, Aria,和QuickQuan 是赛默飞世尔科技旗下产品。

  LDTD 是Phytronix Technologies旗下品牌。

  Thermo Scientific是世界领先的赛默飞世尔科技的重要品牌。

来源:赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)


TAG: thermotranscend多维液相

★◆◆功夫熊猫◆◆★ 引用 删除 snwxf   /   2010-03-18 22:43:51
写得真好!
★◆◆功夫熊猫◆◆★ 引用 删除 snwxf   /   2010-03-17 18:45:13
写得真好!
hongjingzi 引用 删除 hongjingzi   /   2010-03-05 14:21:20
5
hongjingzi 引用 删除 hongjingzi   /   2010-03-05 14:21:19
资料很有用,感谢分享!
 

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