血清中的微小RNAs作为肿瘤标志物的研究进展

　　微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一类全长为19～25个核糖核苷酸的非编码调控单链小分子RNA,由一段具有发卡环结构的单链RNA前体剪切后生成,通过与目标mRNA 分子的3-端非编码区域(3-UTR)互补配对使目标mRNA分子的翻译受到抑制，从而在转录后对靶基因的表达水平进行调控。根据miRBase数据库现已发现的miRNAs达9500多个，研究证实很多miRNAs与肿瘤的发生发展有关。最近一些研究发现， miRNAs不仅可以在血清中稳定存在，并且许多肿瘤患者血清中的一些miRNAs的表达明显与正常人不同，可以作为一种特异的肿瘤标志物进行测定。

　　1 血清中miRNAs的稳定性

　　1.1 血清中存在着大量的miRNAs

　　随着越来越多的miRNAs功能的发现，许多学者开始关注miRNA在血清中的表达情况。Tsang[1]提出血清中的miRNAs可能与机体某些组织器官的功能减退、缺失有关。但有些人怀疑血清中的miRNAs是否来至其他的小RNA或仅仅是rRNA、mRNA等的裂解片段?Chen等[2]选取21例健康人，其中11例男性，10例女性，同时还入选了：肺癌、直肠癌、糖尿病患者，用Solexa技术对其血清中所有的小于30nt的RNAs进行测序，结果显示不论健康人或患者血清中都存在大量的miRNA，部分mRNA、rRNA及少量未知RNA，证明了血清中确实含有大量的miRNAs，而不是来自其他的转变;并且该试验还发现大鼠、小鼠、牛及其胎儿、马等的血清中也存在大量的miRNAs，这为我们对血清中的miRNAs进行临床疾病研究提供了依据。Gilad等[3]发现利用qRT-PCR技术可以对人体的尿液、唾液、羊水及胸水中的miRNAs进行定量，为我们研究miRNAs开辟了新的途径，这些体液中的miRNAs表达异常可能预示着机体功能的改变，有待进一步研究。

　　1.2 miRNAs对酶的耐受性

　　虽然血清中确实含有大量的miRNAs，但是否它们仅仅是一过性的表达，因为血清中含大量的各种消化酶，其中主要是核糖核酸酶。也许不久那些miRNA就会被消化掉，Mitchell等[4]用新杆状线虫miR-39、miR-54、miR-238(在人类中无表达)与人体内生的miR-15b、miR-16、miR-24作对照，结果发现前者加入新鲜的血清中，在不到2min的时间内就很快消失，而后者无明显改变。Chen等[2]通过肺癌患者细胞中的18srRNA、28srRNA、GAPDH、U6等基因、患者细胞中的总RNA、血清中的miRNAs对比，分别给予3h、过夜核糖核酸酶的消化，结果GAPDH、U6等很快消失;肺癌细胞中的RNA约有一半减少，而血清中的miRNAs则无明显改变,可见血清中内生的miRNAs可以逃脱核糖核酸酶的消化。但对于miRNAs逃脱酶消化的机制众说不一，并不清楚。Caby等[5]发现血清中含有大量的膜结合酶微粒;van Niel等[6]提出--血清中的miRNAs先被一种50～90 nm大小的外来体包装，在条件成熟后才被释放出来;Valad等[7]报道膜结合酶中含有miRNAs。可认为血清中的miRNAs是受到一种膜结合酶的保护才免于被消化，但关于他们是怎样结合及哪些因素引起释放，这些过程中miRNAs的功能是否发生变化等问题，还没有合理的解释。

　　1.3外界条件对miRNAs的影响

　　虽然血清中的miRNAs可以避免酶的消化，但是如果作为一种有价值的肿瘤标志物、或其他疾病的特异性指标，首先要排除一些外来干扰因素，这些直接关系到它应用于临床的可行性。紧接着有许多研究者对血清中的miRNAs做了进一步的观察，并设计了各种可能影响miRNAs变化的因素，包括：放置时间长短，温度变化、PH值的高低等，结果显示这些均对血清中miRNAs无明显影响，放置时间3、6、24 h，pH=1、pH=13,温度-80℃、0℃或100℃等，血清中的miRNAs均无明显变化[2，4]。由此证明了血清中miRNAs不但可以抵抗酶的消化，而且耐酸耐碱，更不受温度变化及留置时间的影响，比一般的蛋白更适宜作为肿瘤标志物。Chen等[2]为了排除miRNAs在PCR过程中受到DNA、mRNA、rRNA等污染的可能性，他们对miR-21、103、192、24、25等给予两种qRT-PCR扩增测定，一组加入核糖核酸酶，另一组则无核糖核酸酶，结果二者无差异。该实验也证明了血清中miRNAs在个体中的稳定性，未来miRNAs也许可以作为早期诊断和指导个体化治疗的观察指标。

　　2 肿瘤患者血清中miRNAs的异常表达

　　既然已经证明血清中miRNAs的非常稳定，很多试验及临床分析也表明miRNAs能够调节癌基因和抑癌基因，从而发挥促癌或抑癌作用。最近许多研究表明miRNAs与肿瘤的分期、转移、药物疗效及预后均有密切的联系。并且很多与肿瘤有关的miRNAs已被证实，如Volinia等[8]报道miR-128b、miR-152、miR-205、miR-222、miR-24、miR-150等在肺癌患者组织中高表达;miR-29a、miR-221、miR-223、miR-25、miR-92、miR-99a等在结直肠癌患者组织中高表达。Wang等[9]发现miR-31在大肠癌中高表达，且与TNM分期、肿块侵润程度均有关(P值分别为 0.026、 0.024)，并且发现miR-143仅在结肠癌中低表达P = 0.023，在直肠癌与正常黏膜中无明显差异P=0.351。另外Hiyoshi等[10]报道miR-21在食管癌患者中的高表达与肿块的血管侵犯、淋巴结转移有关。但与肿瘤发生发展相关的miRNA是否在血清中表达呢?表达情况如何呢?Lawrie等[11]对已报道证实的与B型细胞淋巴瘤有关的miR-155、miR-210、miR-21在血清中作了测定：试验选取了60例患者，43例健康人作为对照，在血清中提取miRNA后，用PCR技术扩增后测定，患者血清中的miR-155、miR-210、miR-21表达明显高于对照组，P值分别为：0.009、0.02、0.04。并且还发现miR-21与患者的无病生存率相关(P=0.05)，也许某些miRNAs可以作为患者疾病复发的检测指标。

　　Chen等[2]的研究中发现非小细胞肺癌、直肠癌患者血清中的miRNAs与健康人明显不同，非小细胞肺癌患者与健康人相比：28个miRNAs是缺失的,63个miRNAs是肺癌患者所特有的，(r=0.2 429);69种miRNAs在直肠癌患者血清中高表达，而在正常人中则不表达(r=0.1 588)。而且还发现非小细胞肺癌与直肠癌患者之间含有部分相同的miRNAs，如miR-134、miR-146a、miR-221、miR-222、miR-23a等，认为这部分miRNAs可能参与各种肿瘤的形成，有着共同的致癌机制。关于其作用机制，Stern-Ginossa等[12]认为miRNAs通过与组织相容性复合体Ⅰ类相关链A(MICA)、MICB抗原结合而发挥免疫及炎症反应，miRNAs与MICA、MICB上相应位点结合后，帮助它们逃避来自免疫系统不必要的识别和进攻，并推测肿瘤利用了同样的机制来逃逸免疫检测。Volinia等[13]报道miR-25、miR-223等在肺癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤中高表达，提出可能是致癌基因;Kumar等[14]在小鼠模型中发现传染let-7g miRNA可以影响细胞周期:G0-G1、 G2-M增多，S期减少;Chen等[2]也在他们的试验中对这3个基因进行了测定：miR-25、miR-223在非小细胞肺癌患者血清中明显高表达，高于正常人，而let-7无明显差异P=0.11,原因可能是肿瘤细胞不分泌let-7。Hunter等[15]比较了血浆微粒中的miRNAs与细胞中的miRNAs区别：发现微粒中有33个miRNAs与细胞中的miRNAs表达明显不同。Chen等[2]同时比较了患者与对照组中无致病性的miRNAs的表达情况，结果差异无统计学意义，说明血清中肿瘤有关的miRNAs不会导致正常的miRNAs发生变化。

　　Mitchell等[4]发现miRNA-141在25例前列腺癌患者血清中均高表达，可以达到60%的敏感性、100%的特异性，并且与前列腺特异性抗原(PSA)的表达水平有一定的关系。近来Resnick等[16]对卵巢上皮癌患者血清中的miRNAs也进行了测定：28例患者的血清均在治疗前收集，正常未婚者作对照，结果显示：miR-21、miR-92、miR-93、miR-126、miR-29b在患者中明显高表达，而miR-155、miR-127、miR-99b则低表达，并且发现miR-21、miR-92、miR-93在患者CA-125升高以前出现，所以预示着这3种miRNAs可以作为癌基因治疗靶点及卵巢上皮癌早期发现的标志物。Jackson[17]报道血清中的miRNA有望像BCR-ABL、HER2一样应用于临床的靶向药物治疗。各种肿瘤的临床用药均存在不同程度的损伤肝功能的副作用，Wang等[18]在小鼠肝损伤模型中发现一些在肝组织中高表达的miRNAs，如miR-122、miR-192可以在小鼠血清中持续高表达，这些血清中的miRNAs在肝损伤早期就可以检测出来，所以他们提出miR-122、miR-192可以作为药物性肝损伤的早期诊断指标。

　　3 结语

　　综上所述， 血清中miRNAs比较稳定，对肿瘤患者诊断具有较好的敏感性及特异性，加上取材的相对无创性，显示出了其作为肿瘤标志物的优势，但距临床应用还有一定距离。寻找和验证各种肿瘤的特异性miRNAs是我们首先需要解决的问题，建立适合临床应用的标准化检测体系，包括质控和诊断阀值的确定等都有待继续努力。再者还有许多miRNAs 的功能有待去探索，包括miRNAs是如何进入到血清中及稳定存在的机制还不清楚。虽然有关血清中的miRNAs研究刚刚开始，但为肿瘤标志物的研究开辟了新的途径，随着研究深入,血清中的miRNAs在肿瘤诊疗中的应用将会取得更多有益于人类健康的新硕果。

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