双黄连粉针剂中黄芩苷的高效毛细管电泳-电导法测定

上一篇 / 下一篇  2010-05-08 15:17:36

  黄芩是植物黄芩的干燥根,为常用中药,有清热泻火、解毒 止血、安胎等作用,其有效成分为黄酮类。目前从黄芩中提取并鉴定出结构的黄酮类成分已有十几种,其中含量较高的是黄芩苷及其苷元黄芩素、汉黄芩苷及其苷元汉黄芩索。药理上已证明黄芩苷是黄芩中的主要成分。它具有抑菌、清热 降压、镇静 利尿、利胆、抗炎抗变态反应、解毒等作用,同时它的扩张血管、抗氧化功能在作为心血管疾病治疗药物上具有极大的潜力.其抗病毒作用在治疗病毒相关疾病如肝炎、爱滋病方面也有广阔的前景。因此建立一种快速、简便、准确的检测方法对医药管理和医药的质量监控有重要的意义

  目前,采用高教液相色谱法对黄芩苷研究得较多,毛细管电泳的应用较少,且多为光学检测。电化学检测具有灵敏、价廉的优点,其中电导检测器作为一种通用型的检测器,检测范围广,有较大的应用范围:我们首次采用高效毛细管电泳-电导控测法对国家级新药双黄连粉针剂中的黄芩苷不经预分离,直接进行了测定,取得丁令人满意的结果.

  1 实验部分

  1.1 仪器与主要试剂

  毛细管电泳仪:CZE30PN10/MCN Z2型高压电源(美国High Voltage Electronics Corp.),石英毛细管柱50cm×75μm(河北永年光导纤维厂).DDS-11A型电导率倥(上海第二分析仪器厂,经改装),毛细管电泳数据工作站 (CES98中山大学化学系);pHS-3C型精密酸度计(上海电光器件厂)。三羟基甲基甲烷(Tris,上海试剂二厂,分析纯);硼酸(H3BO3,广州化学试剂广.分析纯);黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所提供),双黄连粉针剂(哈尔滨医药股份有限公司中药二厂.批号9911009);其余试剂均为分析纯;水为二次去离子水。

  1.2 缓冲液和标准溶液的配制

  分别制备0.1 mol/L Tris和0.1mol/L H3BO3储备液。各取适量后,制备不同浓度的缓冲溶液。

  精密称取黄芩苷对照品50mg放置于50mL的容量瓶中,用50%(φ)的乙醇溶解,配制成1000mg/L的标准溶液。进样时稀释成15mg/L。

  1.3 双黄连粉针剂样品的配制

  取双黄连粉针剂10mg于100mL的容量瓶中,用50%(φ)的乙醇溶解.配成100mg/L的样品溶液,直接进样。

  1.4 实验方法

  按文献联接好毛细管电泳仪和检测装置,毛细管柱在使用前依次用0.1mol/L NaOH、蒸馏水和缓冲溶液各冲洗约5min。采用重力进样方式,进样高度差为20cm.进样时间为1:5 s,分离电压为18kV 电导率仪量程:×100红档,高周检测)的输出信号经数据工作站采集到微机中进行实时数据处理、图形显示和数据文件存储。实验在恒温(25℃)、恒湿(相对湿度65%)的实验条件下进行。

  2 结果与讨论

  2.1 缓冲溶液的选择

  缓冲溶液的选择直接影响离子的迁移和最后的分离 在毛细管电泳电导检测过程中,选择的缓冲液通常要遵循下述几个要求:(1)在所选择的pH范围内有很好的缓冲容量;(2)自身的迁移率低,即分子大而电荷小,以减少电流的产生:(3)缓冲溶液的背景电导低;(4)为了减少电极极化的产生,最好在喊性条件下检测。

  比较了NH4Cl- NH3;、Na3HPO4-NaH3PO4 、Na2B2O7-H3BO3、Tris-H3B03几种缓冲体系对分析的影响。前3种体系.由于离子强度大、电导高.不能采用高浓度的缓冲液.限制了缓冲容量,若按比例提高缓冲液浓度或增大分离电压,引起电流的巨大变化,焦耳热的增加对分析不利:而Tris体系的离子质量太,电导低,采用高浓度、高电压不会产生太电流(浓度从5mmol/L变化至25mmol/L,电流变化只有2μA;电压从6kV变化至21kv,电流只变化1μA),因此可以通过提高缓冲液的浓度和分离电压来改善分离度和缩短分析时间,是一种比较理想的缓冲体系,同时硼酸能够和黄芩苷糖基上的羟基按以下方式进行络合,生成络阴离子,其出峰时间在系统峰之后。

  2.2 缓冲溶液浓度的影响

  在高效毛细管电泳中,缓冲溶液的浓度是一个很重要的指标。保持溶液 pH 8.5,增加浓度,离子强度增加,明显改变缓冲溶液的容量,减少溶质和管壁之间、被分离离子和离子之间的相互作用,从而改善分离;缓冲溶液的浓度过大将产生大量的焦耳热,导致峰形变坏。因此需要选择合适的缓冲溶液浓度以获得较高的灵敏度和良好的分离度。分别改变Tris(5~25 mmol/L)和H3B03(O.5~2.5mmol/L)的浓度,实验结果表明:Tris浓度低,峰形拖尾严重,可能是因为低离子强度的缓冲液,造成了样品吸附;Tris浓度高时,峰形得到改善;H3BO3,浓度低,配位剂的浓度不够,灵敏度受到限制;当H3B03,浓度达1.0mmol/L,峰高不随硼酸浓度增高而变化.可能是硼酸和黄芩苷配位达到平衡。从分离效果和节省试剂的角度考虑,选择Tris和H3BO3分别为15和1.5mmol/L的 Tris-H3B03为分离缓冲液(经检测,pH恰为8.5)。

  2.3 进样时间的影响

  采用虹吸进样,在一定的进样高度下,进样时间决定了进样量的大小。进样量太小,达不到检测器的灵敏度;进样量太大,样品塞长度超过扩散引起的区带增宽,分离效率和分离度都变差。考察进样时间5~30s,选择15s为最佳分离时间。

  2.4 分离电压的影响

  毛细管电泳优于传统电泳在于毛细管能有效散热,因而能外加高电压,大大地提高了分离度和缩短了分析时间;分离电压过高,在不能有效地驱散所产生的焦耳热情况下,会引起柱效和分离度的降低。分离电压从6kV 变化至2lkv,电泳电流变化不大(0.5~1.5μA),但出峰时间有明显变化。在6kV时,20min内无峰出现。随着电压的增加,出峰时间迅速提前,实验选择18kV作为分离电压。

  2.5 方法的线性及重复性

  在上述实验条件下.重复进样6次,黄芩昔的迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.4%和2.O%。在选定条件下,黄葶苷的峰面积(y)与质量浓度(mg/L)有良好的线性关系。线性回归方程为 y=160.17x一1348.30.r=0.9987.其线性范围为l0~720mg/L,检出限(S/N=3)为2.5mg/L。结果表明,本法具有良好的重复性和线性检测范围.

  2.6 样品测定及加标回收实验

  将配好的双黄连粉针剂样品试液直接进样,由回归方程计算其含量。取双黄连粉针剂样品试液20mL 3份,分别加人不同量的黄芩苷标准样品,按1.3方法,定容于25mL容量瓶中,进行加标回收实验,计算回收率。

  参考文献

  [1]何心.石春伟.冯毅,等高效液相色谱-电化学法测定双黄连粉针剂中黄芩苷和黄芩素的含量【J】.中国中药杂志.1997.22(10):604—605.

  [2]刘华钢.黄海滨.陈左.HPLC法测定柴黄片中黄芩甙的含量【J】中国中药杂志,1997,22(11):674—675

  [3]沈嘉.吴秋嵋.HPLC法比较不同工艺制备的黄连解毒汤及日本汗方黄连解毒汤中黄芩苷含量【J】中草药,1999,30(2):102—103.


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