肝组织透射电镜观察

　　肝为五脏之一，主疏泄、藏血，在人体生理和病理活动中起着重要的作用，因而倍受重视。肝病，包括各类肝炎、肝硬化、肝癌等是我国的多发病。因此，掌握肝组织的电镜研究方法对中医实验研究很有必要。

　　一、原理

　　人或动物的肝组织属柔软含水物体，在一般的电镜下，不能直接观察;也不能作超薄切片。超薄切片技术就是通过固定、脱水、浸透、包埋使之成为坚硬的固体而能在超薄切片机上进行超薄切片。而且在整个制样过程中，又不能使肝组织细胞原来的结构遭受破坏。

　　另外，肝组织和其他生物组织一样，主要是由较轻的低原子序数的原子如碳、氢、氧、氮等元素所组成，肝组织样品中的这些原子，其电子散射能力很小。而且样品被切成菲薄的切片(一般为50～70nm)，电子散射能力更弱，反差很低，无法摄得对比度清楚的电镜照片。在样品制备过程中用重金属进行染色，就是要提高样品的散射能力。

　　二、实验准备

　　1.器材

　　存放电镜标本的小瓶子(一般用青霉素瓶)

　　眼科手术剪刀、镊子

　　剃须刀片

　　玻璃吸管

　　玻璃量筒、玻璃烧杯

　　塑料小砧板

　　牙签

　　大小广口玻璃瓶(存放锇酸固定液的必须是棕色瓶)

　　天平、称量纸

　　pH酸度计

　　存放洗涤液、缓冲液、脱水剂所需的洁净玻璃瓶(容量500ml以上)

　　磁力棒、磁力搅拌机

　　微量OT针筒

　　搪瓷浸透盘

　　定向包埋模板

　　胶囊及胶囊架

　　电热吹风机

　　隔水恒温烤箱(37℃及60℃两种)

　　吸水纸

　　超薄切片机及其附属设备

　　超声波清洗设备

　　修块机和制刀机

　　特制玻璃条(制玻璃刀用)

　　玻璃刀或钻石刀

　　金属载网

　　专用镊子

　　滤纸

　　培养皿

　　双筒显微镜

　　载玻片

　　棕色广口玻璃瓶(容量500ml以上，存放铀染液用)

　　50ml的专用容量瓶(存放铅染液用)

　　牙科用红腊片

　　塑料小盒

　　透射电镜及其附属设备

　　2.试剂

　　2%戊二醛(Glutaraldehyde，C5H8O2)固定液(作前固定用)

　　0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液(pH7.4)92ml

　　25%戊二醛原液8ml

　　存放于4℃冰箱保存。

　　2%锇酸(Osmium Tetroxide，OsO4)水溶液(母液)

　　锇酸1g

　　双蒸水50ml

　　配制于棕色磨口玻璃瓶内。存放于4℃冰箱保存。

　　1%的锇酸固定液(作后固定用)

　　0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液1份

　　2%的锇酸水溶液母液1份

　　存放于4℃冰箱保存。

　　0.2mol/L二甲砷酸钠缓冲液(母液)：

　　二甲砷酸钠42.8g

　　氯化钙1.0g

　　双蒸水加至1000ml

　　0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液

　　0.2mol/L二甲砷酸钠缓冲液(母液)250ml

　　双蒸水250ml

　　最后用1 N HC1 将pH调至7.4，存放于4℃冰箱内保存。

　　洗涤液(0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液)

　　脱水剂： 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇

　　环氧丙烷

　　70%的乙醇醋酸铀饱和液

　　包埋剂

　　618环氧树脂(国产)4.5 g

　　十二碳烯基丁二酸酐(DDSA)3.5g

　　邻苯二甲酸二丁酯(DBP)0.35 g

　　2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酚(DMP-30)0.075 ml

　　(在上三药品充分拌匀后，缓慢点滴加入)。

　　0.5%聚乙烯醇缩甲醛(Formvar )液(氯仿配制)

　　铀染色液： 70%乙醇醋酸铀饱和液(醋酸铀或醋酸双氧铀一定量溶于70%乙醇中，以出现不能溶解，发生沉淀为度)。

　　铅染色液：柠檬酸铅(或叫枸椽酸铅)染色液

　　硝酸铅[Pb(NO3)2]1.33g

　　柠檬酸钠[Na3(C6H5O7)·2H2O]1.76g

　　双蒸水30ml

　　将以上悬液盛于有刻度的50ml容量瓶中，激烈地不断地摇动30分钟后，加入8ml新鲜配制的1N的NaOH，此时乳白色的混浊液立即变为无色透明溶液，再用双蒸水加至50ml后备用。该染色液的pH为12，可保存数月。

　　3.实验材料

　　大鼠肝

　　碎冰

　　三、实验步骤

　　1. 取材

　　断头处死大鼠，迅速取出肝脏，用锋利剃须双面刀片切成大小为1mm3的肝组织，快速将组织浸入固定液，最好不要超过3分钟。

　　2.固定

　　(1)将肝组织块投入2%戊二醛固定液中，在4℃下作前固定1～2小时，固定液用量不宜少于组织块体积的40倍。

　　(2)在4℃下用二甲砷酸钠缓冲液或洗涤液洗涤漂洗2小时(4℃)或更长时间，中间换液数次(至少三次)。

　　(3)然后在4℃下用1%锇酸固定1.5～2小时。

　　3.脱水

　　将组织依次放入30%、50%乙醇、70%的乙醇醋酸铀饱和液(以上均为0℃～4℃)各约10分钟(最后一步，可置于冰箱过夜);再依次放入80%、90%、100%、100%乙醇(室温)各约10分钟。

　　4.浸透

　　组织块移入环氧丙烷20分钟;再用环氧丙烷和包埋液按1：1混合浸透1～2小时(37℃)，再进入纯包埋液中浸透2小时，室温浸透(中间换一次包埋液)。

　　5. 包埋

　　(1)用牙签棒将组织块从上述浸透液中转移到胶囊底部或包埋膜板槽的顶部，然后用包埋液把胶囊或模板槽灌满。把写好标本编号纸卷成环状放在胶囊的上部，或放在模板槽内。

　　(2)将装有组织块的胶囊或模板放在37℃温箱中浸透4小时或过夜。

　　(3)然后再转入到60℃温箱，放置48小时，使其聚合。硬化后从温箱中取出，让其自然冷却。

　　6. 超薄切片

　　(1)包埋块的修整

　　组织块的修切对于超薄切片有很大影响，原则上组织块修得越小，切片越能够切得薄。

　　在许多情况下，常需要先切一些面积较大的厚切片(半薄切片)在光学显微镜下检查，然后考虑选取某些细胞或组织块某一部分作超薄切片。这样可以将组织块修切到0.5mm2或者稍大的面积。目前多半采用徒手修块法。把组织包埋块园端朝上装进样品夹上，放在双筒解剖镜下，调好灯光，一手紧持样品夹，一手拿新的刀片，先在包埋块的顶端平切一刀，露出组织，然后再在组织的四周以和水平面成45°的角度切四刀。这时组织面可稍为大些，以便切取半薄切片(0.5～2.0μ)，在相差显微镜下检查或染色观察之后，进一步定位进行超薄切片，定位后再修切至所需的尽可能小的组织切面。

　　组织块的形状可以直接修成正方形、长方形或梯形。

　　手工修块虽简便迅速，但准确性较差，表面也不够光滑平坦。近年来已有商品修块机出售，它们可保证锥体四面彼此精确地互相垂直，有助于切出高质量的超薄切片。

　　(2)金属载网的准备及支持膜的制作

　　常用的载网有铜网、不锈钢网、还有用镍、铂、尼龙等组成的载网。一般常用铜网，其它的常在某些电镜的组织化学实验中使用。

　　支持膜用Formvar(学名为聚乙烯醇缩甲醛)制作。先用氯仿配制成浓度为0.5%的制膜液，用干净的载玻片浸入该液中静置片刻，取出后垂直放在一滤纸上使多余的溶液流干。用锋利刀片或小针头沿膜的四周划一刻痕，小心将膜漂浮于水面上，再把载网排列膜上，用滤纸轻轻捞起晾干备用。制膜时室内相对湿度要求在60%以下，如湿度太大，容易在膜上出现微孔。Formvar具有较好的机械强度和透明度，但formvar膜在电子束轰击下易发生变形或小部分发生分解，为此，在高分辨工作中，经常要再喷涂上一层碳膜加固。

　　(3)制玻璃刀

　　当前用于超薄切片的刀有钻石刀和玻璃刀。前者坚硬耐用，但价格昂贵。后者价格便宜，易于制作，可以制出很锐利的刀刃，因此受到最普遍的使用。

　　玻璃刀的制作有手工和机制两种方法。手工制刀时，首先选择厚约5～6mm、内应力小、从断面观察呈淡黄色、白色或略带绿色的硬质玻璃，用钻石玻璃刀把洗净过的玻璃制成2.5×2.5cm或3.0×3.0cm的正方形小块;然后从近乎对角的部位(距边缘约0.5mm)划一条约45°角的直线，再用平口钳平行地夹住对角线的两边，向相反的方向拉成两块刀，其中成45°锐利的一块便是所需的玻璃刀。在双筒解剖镜或低倍显微镜下检查，刀刃平整光滑，无锯齿状波纹者为适用。

　　(4)刀槽及液面的调节

　　超薄切片只有漂浮在水面上或其他合适的液面上才便于收集、伸展和捞取，为此在刀口背部装上一个小的水容器，通常称为“刀槽”。通常用定制的硬塑料刀槽架或用一小段医用橡皮胶缠绕过刀背，紧紧地粘在玻璃上，橡皮胶的后下部分用融化的牙科用红腊密封，以防漏水。注意橡皮胶的顶端不应高出刀刃。

　　切片前在刀槽内加入双蒸水，使切后的切片漂浮于液面上。液面的调节一般先加稍过量的液体使之凸起，以保证浸湿刀刃。然后在双筒解剖镜下用注射器或移液管慢慢吸去一部分液体，调整照明系统，当液面变成凹面、可见一反射光线的弧面，即为正确的液面。从这一光亮的反射光可看到切出的片子。在切片过程中由于液体蒸发，需加液以保证正确的液面。

　　(5)超薄切片

　　切片时将夹着修好组织块的样品夹安装在切片机的样品臂上，刀台上装好玻璃刀，其高度要与刀台上的标准规等高，后斜角一般在3～5°，在显微镜下使样品块面的上下两条平行边与刀刃平行，如是梯形的应长边在下面。调整好刀刃和组织块的距离，再在刀槽内注入适量的双蒸馏水。将切速放在2～5mm/秒，调节控制切片厚度的电流表，即可切片。当切片停止时，立即打开电吹风，冷却样品臂。捞片后关掉电吹风又可重新切片，或更换新刀。

　　切片厚度的判断。一般是利用反射光干涉色来判断切片的厚度，即从切片表面反射的光和从切片下面的水面的反射光发生干涉现象(见下表)。当用白光时，从双筒显微镜下观察两种光线间的差别。

　　目前公认的树脂包埋切片厚度与干涉色的近似值

干涉色	切片厚度
暗灰色	40nm以下
灰色	40～50nm
银白色	50～70nm
金黄色	70～90nm
紫色	90nm以上

　　紫色切片太厚，电子束不易穿过，故不适用于电镜观察用。金黄色切片其分辨率也比较低。目前一般认为银白色的切片是较理想的厚度，其分辨率可达2.5nm左右。也有人喜欢采用金黄色切片，尤其在细胞化学、放射自显影中较适宜。

　　切片的展平和捞取。在切削过程中，由于切片很薄，经挤压使切片发皱，甚至引起标本结构变形。为此，常用沾有氯仿或二甲苯的滤纸小片移近刀槽液面，试剂挥发性蒸汽可使切片软化伸展。蒸发时间2～3秒钟即可，不能把试剂滴入水槽。

　　捞片时，可用眼睫毛做成的小针把切片轻轻地拨离刀刃，并按需要把切片带分成几段。再用弯头的小镊子夹住铜网的边缘，有支持膜的一面向下，与切片轻轻接触，使切片贴附在铜网的膜上，轻轻提起并把膜面朝上，放于培养皿中无毛的滤纸上，待干经染色后即可电镜观察。

　　7.电子染色

　　预先取一个清洁的培养皿或塑料小盒，内放干净的牙科用的石腊片(先切好长条形)。染色时，加1至数滴铅染色液于腊片上，用镊子夹住载网的边缘，把贴有切片的一面朝下，使载网浮在液滴上，或者倾斜地轻轻插入染液中，盖上培养皿和塑料盖。在室温条件下，染色数分钟～10分钟左右。载网从染液中取出后，必须尽快进行仔细清洗，以防染液蒸发沉淀，同时要避免呼吸直接对准载网，因人呼吸中含有大量的CO2，极易与铅发生化学反应而产生铅颗粒沉淀，污染切片。在放有双蒸馏水的数个小烧杯中，漂洗数次，常用镊子夹着载网清洗，除去载网上残留液然后用小滤纸条充分吸干。用镊子夹着载网清洗时，含在二尖之间的液体，可能会污染别的溶液或超薄切片，必须十分注意。因此在清洗完毕吸干时，用小滤纸条伸入二尖间隙内把液体吸干。

　　8.电镜观察

　　四、实验结果

　　肝细胞为组成肝脏的主质细胞，其数量和体积约占肝实质的80%。肝细胞为多边形，是高分化的细胞，有各种发达的细胞器，常作为细胞学研究的模式。肝细胞直径一般为20~30μ，常随生理、病理状态而改变其大小。位于肝小叶不同部位的肝细胞，其大小也有差别。每个肝细胞有三个面，窦周间隙面、肝细胞面和毛细胆管面。电镜下，正常肝细胞的超微结构几乎具备各种细胞必须具备的的特点，即主要由细胞质膜、细胞质(含各种各样的细胞器)及细胞核等构成。

　　细胞质膜又称生物膜，它包括两部分内容，一是指细胞与外环境之间的界膜，它构成细胞与外环境间的重要屏障;二是指细胞内各种细胞器间(包括细胞核)的界膜。电镜下，细胞质膜经锇酸染色后，呈内外两层电子致密，中间夹有一层透亮层(常称两暗层夹一明层)。每层厚约3nm，三层总厚度为9～10nm。

　　细胞质中有各种各样的细胞器。如核糖体，电镜下为无包膜的电子致密的小颗粒，略呈圆形或椭圆形，平均直径约15～25nm，通常散在分布于细胞质中或附着于内质网上。粗面内质网(简称RER)在电镜下呈扁平膜囊状、小管状或囊泡状结构，在其膜胞质溶胶面有核糖体附着，RER膜厚约6nm，RER膜所包围的囊腔称为RER池或RER腔。光面内质网(简称SER)在电镜下呈小泡状或短管状;也有呈长管状，但较少见;膜的厚度常小于6nm，表面无核糖体附着。高尔基体在超高压电镜下，低倍观察厚切片，整个高尔基体表现为单个网络结构，由波浪形带状或板状结构相互连接成弓形、半球形或球形;高尔基体通常位于细胞中央部位并向四周或某一特定方向伸展，偶而可延伸到质膜下。线粒体在电镜下为双层单位膜包围而成的封闭囊状细胞器，其最外层膜为外膜;里面有内膜，内膜向内折叠形成许多嵴;内外膜之间的腔隙为外腔;内膜所包围的腔隙为内腔。细胞质中还有如溶酶体、微体、中心体、微管和微丝等细胞器，以及胞质内涵物如脂滴等。

　　细胞核通常位于中央，呈圆形或卵圆形。核的最外层为核外膜、核内膜;内外膜之间的间隙为核周间隙;内外膜的融合处为核孔;细胞核中充满着常染色质和异染色质，异染色质常呈团块状，染色较深，常染色质因染色浅淡而难分辨;中间有一个或多个核仁，其电子密度较高，外围无膜包绕。代谢旺盛时，异染色质明显减少;蛋白质合成功能活跃时，核仁可边集。

　　五、注意事项

　　1.取材时注意事项

　　对任何组织或细胞来说，以下几点要记住：

　　(1)快。所取材料尽量保持其生活时的状态，这就要求从麻醉或处死的动物身上取材时操作必须快速力争在处死动物后1分钟内将组织浸入固定液。最慢也须在3分钟内完成。在操作者的头脑中要有这样一个概念：瞬刻的时间差别就会引起超微结构的变化。

　　(2)小。组织块不大于1mm3。这是由于电镜中使用的固定剂穿透力较弱，如锇酸中浸透组织1～1.5小时仅能穿透平均0.3mm，所以要求组织块尽可能切成0.5mm薄。虽然醛类穿透力快一些但也不宜于超过1mm。否则，组织过大的话在外周的组织可以得到良好的固定，而在中央部位的组织由于固定剂不能透入而得不到及时固定，会发生细胞自溶现象。所以组织块宜小容易固定。

　　(3)4℃低温操作。动物组织的血液供给停止后，会发生自溶现象，这是因为组织和细胞内的各种酶，尤其是溶酶体里的各种水解酶释放到组织内，使构成组织结构的主要成份如蛋白质、核酸等迅速降解。为了降低酶的活性，要求在0～4℃的低温条件下操作，所用的容器和器械应预冷。

　　(4)避免损伤。在快速取材时，必须做到器械锋利，用锐利的刀片垂直往下切，切时不要拉、锯、压。避免细胞受到损伤。

　　(5)器材保持干净，不可有污染。

　　2.固定时的注意事项

　　(1)戊二醛固定一般为1～2小时，洗涤液多次浸洗时间原则上同固定时间，以免引起细胞雏缩现象。洗涤液尽量采用同系列缓冲液。

　　(2)锇酸作为固定剂，其固定时间不宜超过2小时，如果固定时间过长，会引起一些脂蛋白复合体溶解，甚至会使组织发脆，造成组织切片困难。

　　3.电子染色时的注意事项

　　(1)铀染色液作片染时，最好先将铀染色液进行离心后取其上清液来作铀染色。

　　(2)铅的染色液很容易与空气中CO2结合，形成碳酸铅沉淀，造成标本的污染，所以在染色时，要尽量减少与空气接触，在操作时尽量避免和人呼出的CO2接近，要迅速盖上盖。有的人为了防止铅沉淀污染，在培养皿内放置NaOH丸或0.1N的NaOH湿的滤纸，以吸收空气中的CO2。

　　一般组织切片用铅染色时间为数分钟～10分钟左右。需要注意是，过长的染色时间，不但不会增加反差，却会出现脱色现象。电镜染色很容易过头，过染的结果使反差全部加强了反而使组织结构之间很少有区别了，这样就失掉了染色的意义。