实验中应该清楚试剂有效期，试剂的其它性质

最近做果蝇胚胎的原位杂交五六次了。原位杂交的基本流程是：探针合成及胚胎收集、固定，预杂交， 杂交，抗体（碱性磷酸酶标记的抗地高辛）孵育，显色。上次（第五次）在显色的那一步遇到问题。以往的四次，都只要一两个小时显色就充分了，而那一次，用时 近二十个小时。

 

开始认为可能是显色前用的碱性磷酸酶缓冲液有问题。在抗体孵育后、显色前，标本需要用 PBS清洗三次去除未结合的抗体，再用碱性磷酸酶缓冲液洗三次，为碱性磷酸酶提供一个适合的离子环境和PH值。为了抑制RNA酶，我在许多缓冲液例如 PBS中都加入了EDTA，但是，是在做了第一次原位杂交之后才加入的。缓冲液保存于500毫升的玻璃瓶，用的时候，先转移50毫升到大的塑料离心管中。 也就是说，第一管50毫升的碱性磷酸酶缓冲液是肯定没加EDTA的，而后面的可能加了。前面几次用的是第一管，上一次用的从500毫升的瓶子里面重新转移 到大离心管中的。但是，当我检查装碱性磷酸酶的瓶子的时候，发现上面并没有注明加了EDTA。由于我有时候会忘记做标记，我还是认为，可能是加了EDTA 但是没有标记。而EDTA可以抑制碱性磷酸酶的活性的。

 

于是做第六次原位杂交。这一次，我重新配了碱性磷酸酶缓冲液，可以肯定是没加EDTA 的了。显色的时候，我只用了一半的标本，但是，显色半个小时候，颜色基本上没有变化！按照这种趋势，肯定又要十几个小时显色才充分，显然，问题不是上次用 的缓冲液加了EDTA，而是另有原因。

 

由于我这次用的探针稀释浓度非常之高（1:1000），而且用了非常严格的洗脱条件， 所以也有可能是探针完全被洗脱了。但是，还有其它的可能吗？

 

我忽然想到抗体失效的问题。于是去检查了抗体的稀释日期。由于抗体的使用浓度是 1:2000，所以我先配了一个1:20的稀释溶液，否则加样太少，无法实现。这个稀释日期是5.21，而前四次都是在6.2之前做的，距离稀释日期少于 等于12天，显色没有问题，第五次，是在6.12做的，距离稀释日期已经有22天，今天距离稀释日期已有29天。

 

同时我想到了导师曾经跟我说过，抗体稀释后的保质期在一周左右。因为以前做免疫染色的 时候，有些抗体稀释了一个月之后仍然有效，我当时并没有太在意这个问题，而今想起来，确实非常可能是稀释的抗体失效了。

 

于是设计了一个简单的实验来检验这个推测。重新做了一个稀释的抗体，加了显色液于解剖 板的三个孔中，然后，第一个孔加入1微升5.21稀释的抗体，第二个加入一微升新稀释的抗体，第三个孔为空白对照，不加抗体。三分钟后，颜色变化非常明 显：第二个孔明显比第一个孔颜色要深，而第三个孔基本上不变色。

 

幸好，我只用了一半的标本显色，还留有一半标本。这样，我就不用从头开始，节约了两天 时间。于是就把另外一半标本重新用今天稀释的抗体孵育，然后再显色。两个小时后，颜色变化就已经很明显了。

 

 

首先，一定要非常清楚试剂的保质期。实验失 败，试剂过期是一个常见原因。如果不清楚试剂保质期有多久，就可能用过期的试剂，导致实验失败，浪费时间。不同的试剂保质期是不一样的，酶、抗体等蛋白质 制品保质期较短，而且稀释后有效期维持更短。很多实验室，为了节约经费，往往会用已经过了保质期的试剂。很多情况下，这些试剂虽然过期，但是还是有效的。如 果实验室有人最近用过而且有效，则可以放心使用。但是，如果不清楚这些试剂是否有效，则使用之前需要设计一个简单的实验来检测。

 

其次，实验用品一定要做好详细的标记，包括： 名称（全称或通用的简称）、配置日期，配置者姓名、PH值、配好后是否又加入了某些试剂等等。标有日期，将来才清楚是否过了有效期。这一次，前面我对显色 失败的原因分析之所以不对，就是因为我没有严格地做到这一点，所以，即使没有标明加了EDTA，我也不能排除已经加过。

 

实验室里常常有前人留下的配好的试剂。对于这些试剂，使用的时候一定要清楚可能失效 了。一般来说，没有标明配制日期而且试剂本身有效期较短且试剂不贵的情况下，应该抛弃。很多试剂，最好是使用自己亲自配制的，否则实验中出了问题难以找出 原因。

 

推而广之，除了应该清楚试剂的有效期之外，还应该清楚试剂的其它性 质。例如，是否有毒？使用的过程中应该注意些什么？如果不清楚哪些试剂有毒、操作中怎样保护自己，就容易使自己受到有毒物质的侵害。除 了毒性之外，还必须清楚试剂的其它注意事项，例如作用的基本原理、配制过程中需要注意哪些问题等等。

 

此外，对于每一次失败，每一个实验中遇到的问题，应该提出至少三 种可能的原因。我之所以第一次分析原因的时候没有找到正确的原因，还在于我只提出了一个可能的原因。事实上，引起问题的可能性是多种多 样的，只提出一个解释，对的几率较小，如果同时提出多个假设，其中有一个正确的可能性就会大大增加。一开始就提出多个可能，可以在做实验检验的时候同时检 测多个因素，这样，就容易通过一次实验找到症结。如果一开始提出一个可能，做实验去检验，发现不对，又提出另外一个可能，再做一次实验，发现还是不对，然 后提出第三种可能，做第三次实验才发现原因，效率就会大大降低。