整体柱HPLC-DAD 法快速测定动物饲料中的九种药物

摘要：最近几年，欧盟立法对饲料中的化学药品添加授权。因此，必须建立一些分析方法来分析饲料以保证与法律规定相符。本文给出一种适合于分析浓度低于1 mg/ kg（这是消费者可以接受的限量）的化学药品，应当被接受为保护消费者安全的方法。此新方法采用一根整体柱，它能明显降低HPLC的分析时间。这一方法可节省分析时间，同时可简化样品制备程序，有利于大体积样品的实验室分析使用。

Abstract：Authorization of the use o many chemotherapeuticals as feed additives has been withdrawn by the EU legislation in recent years. Accordingly, methods are needed to analyze feed stocks to ensure legal compliance. The method proposed in this paper is shown to be suitable for analyzing chemotherapeuticals down to the level of 1 mg/kg, which is an acceptable limit for the protection of consumers. This new method employing a monolithic column has the advantage of reducing the HPLC separation time significantly. This improved time-saving and the simple sample preparation procedure will be beneficial for laboratories with high sample volumes.

        在欧洲，药物被广泛用作饲料添加剂以防止和控制禽畜疾病^[1]。近年来，欧洲已经立法提出对大部分药物的添加加以限制。

        本文发展了一种采用整体柱HPLC-DAD（二极管阵列检测）法同时测定饲料中喹乙醇、卡巴氧、尼卡巴嗪、呋喃妥英、硝基糠腙、呋喃它酮、呋喃唑酮、硝呋柳肼和洛硝达唑等9 种药物的方法。该方法基于2000 年意大利国家动物饲料控制计划^[2]中提供的分析方法。

        洛硝达唑用来控制家禽中的黑头病和防止病原体及微生物对猪的感染。洛硝达唑在70/ 524/EEC 及98/ 19/ EC 中被取缔^[3]。

        硝基呋喃类药（呋喃妥英、硝基糠腙、呋喃它酮、呋喃唑酮和硝呋柳肼）均为抗菌类药物，添加在动物饲料中可促进其生长，同时能控制和防治一些细菌和病原体的感染，如家禽霍乱和球虫病等。

        硝基呋喃类药物为管理规则附录四中禁止的抗生素类药（2377/1990）^[4]。除了硝呋柳肼外，其他硝基呋喃类药物于2003年3月31日在欧洲全部被禁用；此后的管理规则（EC）1756/2002 中也被进一步提及禁用^[5]。

        卡巴氧是一种抗菌类药物，曾作为饲料添加剂用于防治猪痢疾和小猪的细菌肠炎^[6]，同时也被作为生长促进剂使用。喹乙醇是一种合成的猪生长促进剂。这两种化合物被欧洲委员会在（EC）2788/98^[7]中被禁用。所有这些取缔规定的提出基于其在动物体内原始残余量对消费者健康的危害程度决定。

        尼卡巴嗪是4,4’- 二硝基苯氨基甲酰和2-氢氧基-4，6’- 二甲基嘧啶的等当量复合物，作为家禽和兔类的抗球菌类药物被使用。

        目前，根据1831/ 2003^[8]，尼卡巴嗪被允许作为肉用禽类和幼鸡的饲料添加剂，但对其用量有严格限制。其他情况下，根据（E C）2 2 0 5 /2001^[9]均被禁止使用。

        从20 世纪50 年代开始，已经发展了多种用于测定饲料中药物的方法，包括薄层色谱法^[10]、比色测定法^[11]以及HPLC/ UV、HPLC/ MS 等^[12-15]，这些方法对于测定动物饲料中的本底残留量，保护消费者的健康起到了积极的作用。但这些方法均不能同时测定本文所涉及的所有药物。

        本文发展了一种使用整体柱HPLC 测定饲料中药物的方法。

1 实验部分
1.1 药品和溶剂

        丙酮（99.8%）、二氯甲烷(9 9.5% )、甲醇(99.9%)、二甲基甲酰胺（99.8%）以及醋酸钠（99.5%），均为分析纯试剂（Carlo Erba,Milan,Italy）。乙酸（100%）为分析纯试剂（Prolabo, Paris, France）。乙腈（99.9%）为色谱纯试剂（Carlo Erba）。

        标准品和H P L C 的流动相采用Milli-Q（Millipore, Bedford, MA）高纯水配制。液相色谱的流动相先经过0.45 μm 膜（Millipore）过滤，经过纯化的样品在进入液相色谱分析前也需通过17mm、0.45μm 的尼龙网过滤。Al-N 固相微萃取装置是由IST 公司（Mid Glamorgand, U. K.）提供的。

1.2 仪器

        旋转蒸发仪（Büchi, Flawil, Switzerland），带有加热装置的氮气旋转蒸发仪（Liebisch,Bielefeld,Germany）。HPLC 系统由一个P4000的四元梯度泵、带有Rheodyne 7125 型进样阀
（Cotati, CA）的AS 3000 自动进样器、SCM 1000流动相脱气机和UV 6000LP 二极管阵列检测器构成。（除了7125型进样阀外，其余均来自Thermo Electron, San José，CA）。

        HPLC 色谱柱为Chromolith SpeedROD RP-18e柱，50 mm × 4.6 mm i.d. （Merck, Darmstadt,
Germany）。柱温箱温度：30 ℃。HPLC 流动相A 为浓度0.05 mol/L 的乙酸缓冲液（pH 4.5）；流动相B 为纯乙腈。整个分离过程可在6 min 内完成，梯度程序见表1，流速5 mL/min。对洛硝达唑和卡巴氧，二极管阵列检测器的检测波长设定为320 nm；对呋喃妥英、硝基糠腙、呋喃它酮、呋喃唑酮、硝呋柳肼、喹乙醇和尼卡巴嗪，检测波长设定为365 nm。

1.3 标准溶液

        喹乙醇与硝基糠腙购自M P 生物医药公司（Irvine, CA）；洛硝达唑，卡巴氧和尼卡巴嗪购自Sigma（St. Louis, MO）；呋喃妥英，呋喃唑酮，呋喃它酮购自Riedel de Haen（Seelze,Germany）; 硝呋柳肼购自Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Germany)。用二甲基甲酰胺配制成1.0 mg mL-1 的储备液。将这些储备液存储在-20 ℃（除尼卡巴嗪在+4 ℃）不超过3 个月。浓度依次为50.0，25.0，10.0，5.0，2.0，1.0，0.5，
0.1 μg mL-1 的标准溶液，在每天实验前用甲醇/水（60:40，v/v）稀释储备液后得到。

1.4 样品制备

        将5g 颗粒状饲料置于塑料杯中，加入50 mL的二氯甲烷/ 丙酮溶液（1/1，v/v），盖紧瓶盖，在摇床上摇匀1h。然后将溶液在3500r/min 条件下离心15 min，取出2 mL。在50 ℃用氮气将样品吹干。再将残余的样品溶于1mL 甲醇/ 水（80：20，v/v）溶液中，用于固相微萃取纯化。

        将上述1mL 提取物通过Al-N 固相微萃取柱纯化。先用3mL 甲醇和5mL 甲醇/ 水（80：20，v/v）溶液清洗萃取柱。样品采用4mL 60%甲醇和4mL 100% 甲醇洗脱，洗脱液被收集在10mL 的试管中。

        经过纯化的样品在50 ℃条件下用氮气流吹干后复溶于0.5mL 的60% 甲醇溶液中，通过尼龙网过滤。HPLC 进样量20μL。为了对发展的方法加以认证，在空白的鸡饲料中加入一定量的药物配制成标准溶液，具体方法为：在5g 的饲料中分别加入5，10 和25μL 的药物，得到的样品中药物浓度分别对应为1，2 和5mg/kg。在进行提取之前，添加药物的样品可在遮光、室温条件下稳定存放1h。

2 结果和讨论

        混合标准样品的色谱分离图见图1。由365和320 nm 的叠加谱图可以看出，此方法中不同分子在不同波长处有不同的响应值，由此可以获得最大的检测灵敏度。由谱图也可以看到，使用整体柱分析可以在很短的时间内获得较好的分离效果。

        本方法线性回归曲线在最佳波长处测定。各被测药物的浓度与其色谱峰面积都有很好的线性关系（除了尼卡巴嗪，其他药物的相关系数均大于0.998）。结果在表2 中给出，每一实验重复3 次。

        采用所发展的方法，对空白的鸡饲料分成3个不同级别实验（1，2 和5mg/kg），每个实验做6 个样品。图2 显示了空白饲料和相同的家禽饲料在1 mg/kg 时的叠加色谱图。在本文研究的工作中，可以证明被研究的药物组分在保留时间附近没有干扰峰。根据2005 PNAA^[16]，我们也研究了其他饲料（小牛和猪的饲料），其色谱图与家禽饲料相似。

        在质量浓度为1 到5 mg/kg 范围内，通过每次实验运行6 个样品，以空白饲料为样品研究平均回收率和重复性。结果发现回收率为53% 到98%，相对标准偏差（CV）低于10%。回收率和日内重现性都满足要求。

        通过文献^[17]提供的计算方法，以质量浓度为1 mg/kg 的样品为实验样本，根据该样品的6次重复实验结果计算检测限（LOD）：

        LOD=t （0 .9 9）× S D

        这里t （0.99）表示在99% 置信度和（n-1）自由度时的t 值，SD 表示重复分析时的标准偏差。

        定量限（LOQ）是指在特定精确度（重复性）条件下，可以测定的最低样品浓度。CV值小于10% 时，精确度可以接受；这样，对于所有药物样品，LOQ 被认定为1 mg/kg，相关数据被列于表3 中。

3 结论

        本方法适合于分析浓度低至1 mg/ kg 的药物，这一检测限可以满足大多数样品的分析要求。所发展的方法的最大优势为可以大大减少分析时间，非常适合于需要分析大量样品的实验室。再者，由于样品的制备简单易行，此方法可以取代目前正在采用的那些复杂的方法。

参考文献

1. McEvoy, J. D. G. Anal. Chim. Acta 2002, 473,3-26.
2. Ministry of Health, Italian National Plan for Feed Control, 2000.
3. Commission Directive 98/ 19/ EC of 18 March 1998. Amending Council Directive 70/ 524/ EEC
   concerning additives in feedingstuffs.
4. Council Regulation（EEC）No. 2377/ 1990 of 26 June 1990. Laying down a community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin.
5. Council Regulation（EC）No. 1756/ 2002 of 23 September 2002. Amending Council Directive 70/ 524/ EEC concerning additives in feedingstuffs as regards withdrawal of the authorisation of an additive and amending Commission Regulation（EC）No. 2430/1999.
6. Williams, B.J. ; Shively, J. E. Vet. Med./ Small Anim. Clin. 1978, 73, 349.
7. Commission Regulation（EC）No. 2788/ 98 of 22 December 1998. Amending Council Directive 70/ 524/ EEC concerning additives in feedingstuffs as regards the withdrawal of authorisation for certain growth promoters.
8. Regulation（EC）No. 1831/ 2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September2003. On additives for use in animal nutrition.
9. Commission Regulation（EC）No. 2205/2001 of 14 November 2001. Amending Council Directive 70/ 524/ EEC concerning additives in feedingstuffs as regards withdrawal of the authorisation of certain additives.
10. Chieri, U. R. J. AOAC, 1978, 61, 92.
11. Buzard, J. A. ; Ells, V. R. ; Paul, M. F. J. AOAC 1956, 39, 512.
12. Smallidge, R. L. J. Assoc. Anal. Chem. 1985,68, 1033.
13. McCracken, R. J.; Kennedy,D. G. J. Chromatogr.A 1997, 771, 349-54.
14. Van Poucke, C. ; De Keyser, K. ; Baltusnikiene,A. ; McEvoy, J. D. G. ; Van Peteghem, C. Anal.
    Chim. Acta 2003, 483, 99-109.
15. Mortier, L. ; Daeseleire, E. ; Van Peteghem, C.J. Chromatogr. B 2005, 820, 261-70.
16. Ministry of Health, Italian National Plan for Feed Control, 2005. 
17. Perez, N. ; Gutierrez, R. ; Noa, M. ; Diaz, G.;Luna, H.; Escobar, I. ; Munive, Z. J. AOAC Int.2002, 85, 20.