固相萃取与液相色谱以及液相色谱/质谱联用方案的开发和确认

本文描述了评价和确认SPE方法的策略。通过为血清中药物的固相萃取选择和确认合适的吸着剂来说明这个方法。分析了填充床层的穿透体积，它是吸着剂容量的一个量度。本文阐述了小颗粒、高容量性能的吸着剂填装的小的吸附床层具有最好的分析效率。

Strategies are described for evaluating and validating SPE methods.The selection and validation of a generic sorbent for SPE of drugs from plasma is used to illustrate the methodology. The procedure uses frontal analysis to determine the breakthrough volume of the packed bed,which is a measure of the sorbent capacity.This study indicates that small adsorbent beds composed of small particles with high capacity provide the best performance.

        固相萃取(SPE)吸引人的一个特点是适用性强。但在哪些方面不适用，并且是什么原因造成的?现提出与优化方法有关而与上述稍有不同的问题：能不能在时间不变的情况下利用比较小的床层来提高回收效率，并且能够达到多小，采用不同的吸着剂结果如何，颗粒大小对结果有什么影响?综上所述可以认为，SPE缺乏系统的优化方法和确定的萃取步骤。在许多固相萃取方法的建立中，一直把萃取效率看作是检验方法优劣的唯?参数，但仅仅测量回收效率还不足以指出实验失败的原因，例如穿透、在传输管道中和在玻璃器皿上的吸着、由于光线和酶化或氧化的原因而引起的分析物降解等。这些因素使得固相萃取方法建立的实验过程繁杂冗长并且最后确定的条件可能不是最佳的实验条件。

　　由此产生了两种评价和确认固相萃取方法的策略一种是比较吸着剂的保留容量和洗脱效率，另一种是测定样品的萃取回收效率、穿透百分比以及吸附百分比。但两种方法中哪一种方法比较适合于优化和确认样品的预处理步骤经常被忽略。目前需选择和确认一种通用的适于从血浆中提取药物实验吸着剂以用于解释说明的方法论。

1自动化固相萃取

　　选择一个Prospkt(Spark Holland，Emmen，The Netherlands)自动化固相萃取样品预处理装置(如图1)作为装置的起始部分。这个部分提供了一个通用的自动平台，包括可替换的固相萃取管，避免接触光和氧气(两者都能引起许多分析物降解并使回收率降低)。

2评价吸着剂

　　商业上有用的吸着剂样品可从不同厂家获得并填充到10mm x 2mm的Prospekt SPE管中。HySphre^TM C18 8μm，HySphere Resin GP 8μm和HySphere Resin SH 20μm从Spark Holland获得。PLRP-s(18μm)从Polymer Laboratories(Amherst MA)获得。30μm的吸着剂Oasis^TM从Waters Chromatography(Miford，MA)得到。

2．1测定穿透体积

　　前沿分析法(FA)是一种测量填充床层穿透的方便方法。FA是通过泵的作用使稀释的分析物溶液通过床层，然后测量检测器的响应时间。抽吸溶液绕过SPE管，直接进入检测器，如图2所示的A状态。这样就提供了强的检测信号，显示的吸收率相应于100％穿透。接着将阀进行转换，分析物溶液将通过SPE管(图2的B状态)。由于分析物保留在SPE管中，结果检测器没有信号。最后，SPE管被分析物饱和，分析物开始穿透，这个延迟被称作穿透体积，它是吸着剂容量的一个量度。图3给出了一个穿透曲线和定义穿透体积的例子。

　　表1列出了7种不同分析溶质对于5种不同吸着剂的穿透体积。Oasis、GP、SH 3种吸着剂对7种分析溶液中的6种具有高的保留容量，因此，它们是进行下一步研究的最佳候选吸着剂。

2．2测定洗脱效率

　　单独测量穿透体积只是指出了整个图的一部分内容，而忽略了测量曲线的形状。

　　图4比较了PCP通过5种吸着剂的填充床层的穿透曲线。穿透后的曲线锐度就是洗脱效率的量度：比较陡的曲线有较好的洗脱效率，好的洗脱效率说明具有小的洗脱体积，也就是较少的稀释。较少的稀释就具有好的灵敏度。显而易见，HySphere Resin GP和Oasis比Hysphere Resin SH的洗脱效率好得多。这样，候选的吸着剂数量成为两种：HySphere Resin GP和Oasis。为了比较，也将HySphere C18用作下一步研究的吸着剂。

3 SPE方法的认证

3．1样品回收率、穿透量和对系统取样管路吸附量的测定

　　进行SPE方法的建立和认证时，首先应说明的一点是穿透不是一个问题。将另一个SPE管与第1个SPE管串连起来就可以进行研究，如图5所示。样品从自动进样器中以正常模式传送到两个串联管中(图5a)。如果在第1个管中发生穿透，样品将被捕集于到第2个管中。要是没有穿透，在第2个管中将没有任何分析样品。样品在两个管中都没有保留的组分进入废液池，这是SPE的正常模式。用SDU中不含洗脱液的溶液冲洗管路和SPE管后，通过转换阀1、2、3(图5b)用HPLC来测量取样管路和传送管路中溶质的吸附量。然后，转换阀1(图5c)用HPLC来测量管1中的萃取率。下一步，转换阀2将管1中穿透出的大量分析物从管2冲洗到LC中(图5d)。进入管2中穿透出的所有分析物都将被冲洗到分析柱中进行LC分析。

　　用上面描述的方法进行深入的评价和确认应该选择两种吸着剂(HySphere Resin GP和Oasis)中的一种。最后根据所描述的确认方案，用两种吸附剂对含有3种黄嘌呤(可可碱、茶碱以及咖啡因)的混合物进行检验。

　　图6a显示了黄膘吟在管1中的萃取率图6b显示了相应的穿透量(从管2中得到的样品)。由于吸着剂中至少有一种的回收率是100％，因此对于分析物的吸附不需要进行柱管分析。图6a显示了在KySphere C18上既没有可可碱的保留，也没有茶碱的保留(管1中没有出峰)，这可由从图6b观察到的从管2中冲洗出的大的峰所证实。图6b显示了在Oasis上可可碱有穿透。图6b显示了HySphere Resin GP的吸附非常强，管2中没有样品，因而曲线是一条平坦的基线，也就是说没有样品发生穿透；因此，HySphere Resin GP是分析黄嘌呤应该选择的吸着剂，并且是最有前途的通用吸着剂。

3．2血清样品的应用

　　将黄嘌呤添加到血清样品中，把保存添加样品的小瓶放置在Prospekt中，不改变图6所用的任何条件运行SPE萃取方案，结果如图7所示。整个方法的建立和SPE的确认过程只需用几个小时。

4结果与讨论

　　利用可计量的泵、可切换的阀和检测器来研究SPE填充柱的容量和穿透是非常简单的。一般来说，穿透曲线斜率越大，SPE的效果越好。根据本篇和其他研究报告所得出选择吸着剂的经验应该选用小床层、小颗粒和高容量的吸着剂。Prospekt SPE系统比一般的小，仅能够容纳10?50mg的吸着剂。虽然采用小的床层，但仍然能够为分析物提供足够大的容量。检测分析物在吸着剂上的穿透方案非常容易自动化。

　　在SPE过程中优化床层体积是进行研究的一个变量。分析物的穿透是导致在SPE过程中回收率较低的首要因素。为了避免这一点，许多人利用比需要更厚或者容量更高的床层。厚的床层的流速较低；他们在冲洗过程中加大了稀释量。因此为了补偿稀释，需要增加蒸发步骤。但蒸发对许多样品不利，浪费时间并在处理大量含有轻微污染物的流动相时有解决不了的问题，因而污染物存在于大气中对环境造成影响，例如乙睛。

　　建立特殊SPE方法时，Prospekt系统可配置成自动测量回收率、穿透量及吸着量的装置。这是任何一个SPE方法的建立必须研究的部分。

5 总结
　　以上描述的方案服从于对穿透量的筛选，当开发一个SPE-LC方法时，对方案的简单修改也会使开发者要测量回收率、穿透量和在系统内的吸着量。这个方案必须有利于方法建立者去验证SPE-LC分析系统和SPE管。