蛋白组的高通量分析

上一篇 / 下一篇  2008-06-17 17:28:34

可把蛋白学定义为生物系统中所有蛋白质的全部表征。这种方法不仅包括蛋白质的定性分析,也包括对所选蛋白质子集的定量分析、转移修饰后的表征以及蛋白质。蛋白质之间关系的解释。研究发现,在一个单细胞中含有数千个蛋白质,这就需要发展新的仪器设备进行全蛋白质的分析。本文介绍了基于高效液相色谱(HPLC)-质谱(MS)分析的蛋白质组工作站。为了提高HPLC分离系统的分辩能力,采用了与离子交换色谱联用的二维高效液相色谱技术。在离子交换色谱中根据电荷的不同,使蛋白质酶解液中的肤混合物得到分离,接着通过反相高效液相色谱法,根据肽的疏水性的不同进一步实现分离,最后利用超灵敏度的质谱对肋进行检测。

Proteomics may be defined as the complete characterization of the full complement of proteins in a biological system. Such an approach includes not only the identification of proteins but also the quantitation of selected subsets of proteins, the Characterization of post-translational modifications, and the elucidation of protein-protein interactions. Given that thousands of proteins are found in a single cell, this is a daunting task that will need advances in instrumentation. The proteomic workstation described in this article is HPLC-MS based. To increase the resolving power of the HPLC separation, 2-D HPLC techniques are employed using a combination of ion exchange chromatography, where the peptides from a tryptic digest are separated by charge, followed by RP-HPLC, which separates peptides by their hydrophobicity. An ultrasensitive mass spectrometer is employed, for detection.

      最近已经有一些实验室利用二维高效液相色谱法进行了蛋白质混合物的研究[1,3]。本文将蛋白组学定义为生物系统中所有蛋白质的全部表征。这种方法不仅包括蛋白质的定性分析,也包括对所选蛋白质子集的定量分析、转移修饰后的表征(例如蛋白质的磷酸化和蛋白质的糖基化)以及确定蛋白质-蛋白质之间的相互关系及作用途径。

  鸟枪法结合二维高效液相色谱-质谱方法(LC-MS)用来分析蛋白质混合样品。用合适的蛋白酶(一般为胰蛋白酶)酶解蛋白质混合样品,把生成的肽混合物进行HPLC分离,然后用串联质谱将分离后的肽特征化。将得到的质谱碎片信息与基因组库或者蛋白组库的预测结果相比较来进行蛋白质的定性。由于胰蛋白酶的特异性导致蛋白链在赖氨酸和精氨酸的C?端断裂,使大多数的肽在低的pH下带有双电荷。许多蛋白质组的研究是利用单一的二维反相高效液相色谱分离、质谱检测的方法,这种方法易受到色谱柱容量及质谱检测能力的限制。反相高效液相色谱与离子交换色谱联用的二维高效液相色谱技术,提高了HPLC分离系统的分辩能力,蛋白质酶解液中的肽混合物在离子交换色谱中根据电荷的不同被分离,接着通过反相高效液相色谱法,根据肽的疏水性的不同进一步实现分离。这种方法大大降低了在任意给定的时间点上质谱分析多肽混合物的复杂性,使得特殊的多肽得到检测,特别是含量少的或者离子化能力较差的多肽能够被检测。

  现在一些研究小组已经建立了二维高效液相色谱实验平台[3,4]、ProhomeX TM Worksration(Thermo Finnigan,San Jose,CA)是应用到蛋白质组学研究的第一个商业化系统。图1所示的系统,是由一个自动进样装置、两个延迟体积小的HPLC泵、一个10通转换阀和LCQ TM Deca XP离子阱质谱仪(Thermo Finnigan)以及一个直角微电喷雾接口组成。


 
  两个高效液相色谱泵能够满足多级色谱步骤流动相的选择。10通转换阀具有精细制作的构造,能够满足应用的多变性。lCQ Deca XP离子阱质谱仪能够用MS和Data DependentTM MS-MS对肽进行高灵敏检测。微电喷雾接口利用一个与LCQ人口成直角的30m金属针头,并且用毛细管柱(流速:1?2μL/min)和挥发性较弱的缓冲盐系统(氯化铵盐)提供高灵敏度的LC-MS-MS分析。系统的所有硬件都是通过为用户化的蛋白组界面来控制的。

  ProteomeX系统使用了一个离子交换和两个毛细管RP?HPLC柱(Thermo Hypersil-Keystone,Bellefonte,PA),为蛋白组的应用优化了分辨率、灵敏度、回收率、峰拖尾并减少了背景干扰。BioBasicTM离子交换柱(Thermo Hypersil-Keystone)(SCX[强阳离子交换柱],0.32 x l00 mm)是一个高纯度的并经过亲水化涂层失活处理的硅胶(5pm,300Å)制成、含有磺酸功能团的强阳离子交换柱。反相色谱柱(BioBasic,C18,0.18x100mm)也是由类似的高纯度硅胶制成并经密封,从而减少非特异性吸附。

  这个系统有很好的适用性,能够支撑4种基本方法:1)单柱系统的LC-MS分析;2)双柱系统的高通量LC-MS分析;3)样品及其同位素分析;4)二维LC-MS分析。为了说明该系统的功能,现用二维LC-MS分析拟表皮癌细胞溶菌产物的胰蛋白酶消解液。系统构造如图2所示。首先将样品加载进入一个SCX毛细管柱中,然后利用一系列不同浓度的NH4Cl盐溶液将部分样品传输到两个交替的反相毛细管柱中。尽管每一次盐洗脱的样品溶液中含有数百种肤,但与所有样品中含有的肽相比较,大大降低了励目毛细管柱中样品的复杂性。经过反相毛细管柱梯度洗脱分离后的样品利用MS和MS-MS分析,并用TurboSEQUEST® (Thermo Finnigan)软件搜索人体蛋白数据库做定性分析。TurboSWQUEST是Bio Works TM.3.0(Thermo Finnigan)的组成部分,是分析蛋白的一个软件工具包。图3是反相离子色谱图,盐浓度为50、150、250、500 mmol/L,肽从SCX柱中洗脱出来,图3也表明了每一盐浓度下所定性出的蛋白质数量。如果需要进一步提高分辨率,ProteomeX可非常容易改变梯度运行条件或者运行更多的盐浓度洗脱步骤。一个完整的蛋白组分析大概需要运行15个盐浓度洗脱步骤[1,2]




   由TurboSEQUEST软件定性的蛋白质结果见表1。 由表1可见,利用二维高效液相色谱系统能够定性出864种蛋白质,而一维系统(反向)仅有341种。二维系统的另一个优点是每一个蛋白质中有更多的肽得到分析检测,并且定性的可靠性也得到提高(数据没有显示)。对于较少的蛋白混合样品而言,一维系统能够满足要求并且所需的分析时间较短。表2列出了一部分利用Turbo-SEQUEST软件定性出的蛋白质。


 



结论

  ProteomeX Workstation的采用使蛋白组研究工作者能够可靠地进行复杂样品的分析。利用多维液相色谱法可以大大增加在给定的样品中定性出蛋白质的数量,用户化的ProteomeX软件界面使研究人员对复杂的多维LC-MS方法易于编程。LCQ Deca XP离子阱质谱的稳定性和耐用性使得在很长时间内的分析具有可靠性,这对于分析时间长、步骤多的二维LC-MS分析实验来说是非常重要的。

参考文献:

  1. Link AJ, Eng J, Schieltz DM, et al. Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat Biotech 1999; 17:676-82.
  2. Washbum MP, Wolters D, Yates JR. Large scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotech 2001 ; 19: 242-7.
  3. Davis MT, Beirele J, Bures ET, et al. Automated LC-LC-MS-MS platform. using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 2001 ; 752(2):281-91.    
  4. Nishino I, Fujitomo H, Umeda T. Determination of a new oral cephalosporin, cefmatilen hydrochloride hydrate, and its seven metabolites in human and animal plasma and urine by coupled systems of ion-exchange and reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 2000; 749(I): IOI-IO.

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