癌细胞液中蛋白质的二维液相色谱分离

上一篇 / 下一篇  2008-06-19 11:44:09

摘要:所考察的二维液相分离/质谱方法是一种能对细胞蛋白质信息形成二维质量图谱的新方法。该方法用于监测蛋白质变化,诸如用二维凝胶电泳不易检出的翻译后修饰,具有分辨率高和质量精确的优点。该方法有助于推进蛋白组学的研究,特别是癌变过程的研究。并且提供了一个检测生物标记物的详细方法。

Abstract:A key goalinthe5eld of proteomics and cancer research is the ability to rapidly analyze and identify the measurable protein profile in cells, tissues, and even small organisms. Moreover, a methodology is needed that can quantitatively profile the protein composition of a cell and detect even minor modifications or alterations in protein structure at very low levels. The 2-D liquid separations/mass mapping method investigated in this study is a novel method for generating a comprehensive 2-D mass map of the protein content of a cell. The method has the advantages of high resolution and mass accuracy for monitoring changes in proteins, such as posttranslational modifications that are not readily detectable with 2-D gels. The method promises to facilitate progress in proteomic studies, especially in the progression of cancer, and may also provide a detailed method for the detection of biomarkers.

      蛋白组学和癌症研究领域的一个关键目标是快速分析及识别细胞、肌体组织、甚至小生物体组织中可测蛋白质的全谱[1,2]。另外,也需要一种方法能定量表征单个细胞中蛋白质组成并能在愈来愈低的检测水平上测定蛋白质结构的微小变化或修饰。细胞中蛋白质结构的微小变化或修饰可能会导致其功能的改变。蛋白组学全谱的研究方法应该能决速识别目标蛋白质和它的修饰形态及其表达水平上的变化。此外,这种方法必须能提供许多蛋白质的信息,以便使细胞机理发生变化??涉及多种蛋白质的变化,依据形态或结构,它们能够被同时监测。这种能检测蛋白质结构变化的特征可以为研究癌症发生的机理和诊断、细胞过程诸如细胞的老化、生长、对环境的损害或中毒性休克反应提供重要的方向。

    用于细胞中蛋白质表达图谱研究的主要方法是二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-D PAGE)[3,4]。该方技能分离1000多个蛋白质位点,蛋白质位点图谱都具有每种细胞的特征。二维蛋白质点图谱能够提供一个参考,即图谱的改变表示由于疾病或突变引起细胞或组织的非正常变异。此类二维图谱可以用来定位某种癌症导致的蛋白质改变[l,2]。通过图谱分析和视差方法观察两片二维凝胶上蛋白质位点的位置和强度差异,便可得到相关的信息。

  虽然二维凝胶电泳是大规模蛋白质分离最有力的和目前最常用的方法,但是该方法仍然存在显著的缺陷,如速度慢而且劳动强度大。标准形式的二维凝胶至少需要2整天才能完成一次二维凝胶分离和后续的蛋白质染色。另外,不同实验室之间的二维凝胶重现性往往较差,即使在同一实验室,不同批次凝胶之间的重现性也有限。缺乏重现性,就很难对不同凝胶上蛋白质位点之间的精确分子质量的溶解产物进行比较并加以解释。问题在于二维凝胶电泳主要提供蛋白质的分离而不能识别,二维凝胶可提供等电点(pI)和部分分子质量信息。然而由二维凝胶得到的分子质量也许只有5%?10%的准确性,因此只有有限的识别价值。为了识别凝胶点、可以选择质谱识别方法。可是离开其他各种处理凝胶中蛋白质的方法,用MS分析嵌入聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质是不容易的[5,6]。虽然某些处理方法已经自动化,但仍然很慢,而且会造成蛋白质回收率的损失。所以迫切需要开发一种直接与MS相连的蛋白质分离方法。以精确的分子质量作为溶解产物间比较的新标准,这将会改善蛋白质分离的重现性。

  二维凝胶方法在蛋白质分离及其后续分析方面的缺陷促使作者开发不同的蛋白质表征方法,这些方法包含蛋白质的二维液相分离和质量图谱的应用[7]。其结果是在等电点和分子质量基础上可得到细胞中蛋白质含量的二维的、具有高分辩率的真实谱图。二维液相分离包括液相中等电聚焦(1EF)的使用,接着用无孔硅胶反相高效液相色谱(NPS-RP-HPLC)作为第二维[8]。从第二维流出的蛋白质可以直接在线使用ESI-MS或离线使用MALDI。MS检测其固定分子质量。此方法具有几个显著的优点,包括速度和自动化。原则上,1000多个蛋白质能够在数小时内被分离、质量检测和收集,以供进一步分析。二维液相分离法可提供用于ESI-MS或者MALDI-MS分析的纯蛋白质,从而得到高度精确的分子质量数据,其结果是一张优于二维凝胶的蛋白质图谱,由此可以研究蛋白质的形态和详细结构的改变,包括翻译后的修饰。利用该法可分离大量蛋白质,并用酶和质谱方法作进一步分析。

1 实验设计

  本实验使用二维液相分离,继而用在线ESI-MS检测获取一张细胞蛋白质质量图谱。实验如示意图1所示。分离的第一维使用液相中准备的IEF,根据等电点分离蛋白质。所用仪器Rotofor(Bio-Rad,Hercules,CA),蛋白质依据它们的等电点迁移到20个间隔内。IEF这一步耗时3?5h,收集每一组分,用于进一步分离。该方法允许高达数百毫克蛋白质的进样量,同时可以使用相对多的表面活性剂促进所有蛋白质的溶解,因此即使是高度疏水性的膜蛋白,也可以应用该设备来分离。需注意的是,图1中使用的是分析型的minirotofor(Bio-Rad),总体积小得多。

  分离的第二维是使用NPS-RP-HPLC来完成的,本工作的关键是应用无孔介质(Eichrom Technologies,Inc,,Darien,IL)分离大的完整的蛋白质。这类1.5μm、C18涂层无孔硅胶填料与传统多孔子L柱相比,在分离蛋白质时具有重要优势。使用无孔填料避免了蛋白质在多孔材料孔内的粘附,极大地提高了分辨率、分离速度以及蛋白质的回收率。从Rotofor收集起来的每个pI组分可能有50?100个蛋白质,能在大约10?15mhl内分离。实验所用色谱柱为3.0 x 33mm并保持在65℃以增加分离效率和速度。这种短柱可以进行快速分离并且具有良好的分离度。实验时,在流动相为乙腈/水、流速为0.4mL/min条件下进行梯度分离。实验中进样量是个问题,可用大型号柱子(8mm)或者串联柱[9]。将从NPS-RP-HPLC收集的蛋白质馏分进行酶解并用MALDI-MS进一步分析,或在线联结ESI-MS测定完整分子的分子质量。

  此类实验的一个关键问题是蛋白质在液相中的溶解度。所用的溶解步骤将决定能观察到的蛋白质数量和种类。正确的溶解方法是获得细胞中所有蛋白质质量图谱所必需的。作者实验使用的样品涉及多种癌细胞系,裂解过程包括-80℃冷冻。之后将细胞碎片悬浮于含1%正辛基-吡喃葡萄糖苷(OG)、6mol/L尿素、2mol/L硫脲、2%β。巯基乙醇、2.5%Biolyte(Bio-Rad)两性电解质pH 4?10的溶液中,悬浮液在150 000 RCFG下离心1.5h,收集上清液准备作IEF分离。此时原始胞液的水溶性蛋白质主要在上清液中。此处的重点就是为了增加蛋白质的溶解度而使用了非离子性表面活性剂OGL[10-12],表面活性剂必须与仪器、NPS-RP-HPLC分离、MS分析相适应。尿素和硫脲降低非极性蛋白质与水之间的疏水作用,同时在HLPC缓冲溶液中加入0.1%的OG以增强分离时蛋白质的溶解度。

  本实验所用质谱仪为Micromass (Beverly,MA),质量检测器为LCT。该仪器是垂直加速飞行时间(TOF)质谱仪,带有ESI离子化源以使从液相分离流出的大分子蛋白质离子化。该仪器分辨率为5000并具有高的质量精度,对大分子蛋白质而言其准确度可达100?150ppm。在分子质量为50 kD时,相差l0 D的蛋白质便可以分离,而分子质量检测误差为3?7D。高精度的特点对蛋白质识别和确定翻译后修饰是必要的,高分辨率对辨别相似的蛋白质异构体十分重要。仪器的另一重要特征是TOF装置的非扫描性,即通过实验中反复循环和在线分离可以得到高的灵敏度。另外,ESI源是专为HPLC高流量设计的。在本文中,HPLC柱的流出物按1:1比例分为两部分,其中到ESI离子化源的流速为0.2mL/min。

2 结果

  图2示出用ESI-TOF-MS在线检测二维液相分离流出物的部分质量图谱。结果是,对每个IEF组分而言,由NPS-RP-HPLC分离的蛋白质是由MS根据分子质量测定的。每个IEF组分的分离都结合到一个总二维质量图谱中。图2所示的质量图谱是由选择的人红白血病(HEL)细胞溶解产物中的几个pI组分构成的。然而,在最近的工作中已将同样的质量图谱分析方法用于卵巢及乳腺癌细胞系。该图谱提供的信息与用pI和分子质量标记蛋白质的二维凝胶提供的信息相当所有的蛋白质都可根据pI和分子质量而被标出。图2中每个条带(band)代表一个蛋白质分子质量,而蛋白质的相对含量由彩虹色刻度图象(rainbow scale image)表示。整个实验在5?10h内可完成,而且原则上可以实现自动化。质量数据的实际组合仍然很耗时,软件需要进一步开发。目前每个蛋白质峰的ESI质谱都被检测为一系列多电荷峰(mutiply charged peaks),可用MaxEnt软件(Micromass)去卷积及优化以确定质量。

  该方法的一个重要特征是使用LCT得到的高质量的分子质量数据,仪器对蛋白质所达到的分辨率是单独使用二维液相分离不能达到的。MS法的分辨率比二维凝胶高很多。图3示出了图2中一个区域中的的质量谱,经放大,显示出一个条带包括两个峰,这是二维液相单独分离而不能分辨的。利用此方法作者已测定了许多与癌症相关的蛋白质异构体。另外,结合高分辨和质量的高精度还能测定可能存在的翻译后修饰(PTMs),这对癌变是很重要的。

  很多情况下,作者观察到蛋白质分子质量增加80或160D,表明可能存在一个或多个磷酸化基团。利用此信息,其他可能存在的修饰可首先得到确定。然而,其他更广泛的结构测定方法,如用MALDI-MS测定肽谱及用LC-MS-MS分析结构也都要求确定这些PTMs。更有意义的是,该方法可用来跟踪与癌变有关的PTM形态的变化,因为这些PIMs往往与细胞中蛋白质信号机制有关[12]

  与二维凝胶电泳相比,二维液相分离/质谱方法的一个重要优点是具有对蛋白质分子质量进行识别的能力。虽然可能由于蛋白质的修饰,其分子质量数据不能完全与数据库中的数据相匹配,但是蛋白质质量谱技术能自动提供精确的分子质量和pI值以便识别。HPLC流出物可分流并可用馏分收集器将蛋白质溶液收集于微量收集管中,然后进行酶解并用MALDI-MS测定出肽质量指纹谱,用这种方法每天可收集、识别数百个蛋白质。另外,用MS-MS方法可作进一步详细的分析。二维凝胶法不能直接与MS相连,因为蛋白质都嵌入聚丙烯酰胺凝胶中,使用液相分离法可以大大加速癌细胞溶解产物中蛋白质的分离和识别。为了适应临床诊断和基础研究,这些方法应大大降低目前的成本。

  另一重要考虑是该法的广泛性和定量问题。.二维液相分离/质谱方法能够检测的蛋白质分子质量范围为5?85 kD,pI范围为3?10,且在低分子质量及强碱性范围内比二维凝胶有优势,因为在碱性范围内,电泳的结果常常较差。在典型的二维液相分离/质谱分析中,估计至少可以检测和分辨750?1000个组分峰,在分子质量和pI范围内可与标准模式的银染法二维凝胶的分辨宰相媲美。此法仍有很大的改进空间,因为在软件去卷积过程中丢掉了许多低响应的蛋白质分子。二维凝胶在超过100 kD的范围内仍有优势。也许,进一步的改进NPS柱技术能很快达到这个范围。使用LCT检测器能达到2?3个数量级的定量,相当于二维凝胶的染色法。定性分析对于检测与癌变机理相关的蛋白表达变化和相关生物标记的研究十分重要。

3 结论

  二维液相分离/质谱分析是一个新颖的方法,它能够对细胞中蛋白质信息形成二维质量图谱。根据分子质量和pI,该质量图谱类似于二维凝胶电泳的图谱。该方法具有高分辨率和高质量精度的优势,适于监测二维凝胶电泳不能直接测到的诸如PTMs之类的蛋白质的变化。它也能提供高通量分离,识别细胞中的蛋白质,且能极大地降低蛋白质分析的成本,推动蛋白组尤其是癌变机理的研究,也能提供一个分析生物标记物的详尽方法。

参考文献

  1. Proteome research: new frontiers in functional genomics.In: Wilkens MR., Wrilliams KL, Appel RD, Hochstrasser DF, eds. Berlin: Springer, 1997.
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  4. Two-dimensional electrophoresis: the state of the art and future directions. In: Herbert BR, Sanchez JC, Bini L.Ptoteome research: new frontiers in functional genomics,chap 2. Berlin: Springer, 1997: 13-30.
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  6. Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, Mann M. Mass specUometric sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem 1996; 68:850-8.
  7. Wall DB, Kachman MT, Parus SJ, Lubman DM. A 2-D cellular protein map generated by isoelectric focusing nonporous RP HPLC ESI-TOF MS. Submitted.
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TAG: 液相色谱癌细胞蛋白rotofornps-rp-hplcmicromass

chiraler的个人空间 引用 删除 chiraler   /   2009-01-16 00:41:52
很好的工作!
 

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