标准正文

注射用重组入促红素(CHO细胞)

汉语拼音: Zhusheyong Chongzu Ren Cuhongsu(CHO Xibao)
英文名: Recombinant Human ErythroPOietin for Injection(CHO Cell)
药物组成: 本品系由含有高效表达人红细胞生成素(简称人促红素)基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经细胞培养、分离和高度纯化后冻干制成。含适宜稳定剂,不含防腐剂和抗生素。
中西药分类: 生物制品(治疗类)
生物制品制备: 1 基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2制造 2.1工程细胞 2.1.1名称及来源 重组人促红素工程细胞系由带有人促红素基因的重组质粒转染的CHO-dhfr-(二氢叶酸还原酶基因缺陷型细胞)细胞系。 2.1.2细胞库建立、传代及保存 由原始细胞库的细胞传代,扩增后冻存于液氮中,作为主细胞库;从主细胞库的细胞传代,扩增后冻存于液氮中,作为工作细胞库。每次传代不超过批准的代次。细胞系冻存于液氮中,检定合格后方可用于生产。 2.1.3主细胞库及工作细胞库细胞的检定 应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定。 2.1.3.1外源因子检查 细菌和真菌(附录Ⅻ A)、支原体(附录Ⅻ B)、病毒检查(附录Ⅻ C)均应为阴性。 2.1.3.2细胞鉴别试验 应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标记物等任一方法进行鉴别,应为典型CHO细胞。 2.1.3.3人促红素表达量 应不低于原始细胞库细胞表达量。 2.2原液 2.2.1细胞的复苏与扩增 从工作细胞库来源的细胞复苏后,于含灭能小牛血清培养液中进行传代、扩增,供转瓶或细胞培养罐接种用。小牛血清的质量应符合规定(附录Ⅻ D)。 2.2.2细胞培养液 生产用细胞培养液应不含牛血清和任何抗生素。 2.2.3细胞培养 细胞培养全过程应严格按照无菌操作。细胞培养时间可根据细胞生长情况而定。 2.2.4分离纯化 收集的培养液采用经批准的超滤法或其他适宜方法进行浓缩,多步色谱纯化后制得高纯度的重组人促红素,即为人促红素原液。除菌过滤后保存于适宜温度,并规定其有效期。 2.2.5原液检定 按3.1项进行。 2.3半成品 2.3.1配制与除菌 原液加入适宜稳定剂,并用缓冲液稀释。除菌过滤后即为半成品。 2.3.2半成品检定 按3.2项进行。 2.4成品 2.4.1分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.4.2分装及冻干 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。半成品应及时分装、冷冻。冻干的全过程中,制品温度应不高于30℃。 2.4.3规格 应为经批准的规格。 2.4.4包装 应符合“生物制品包装规程”规定。 3检定 3.1原液检定 3.1.1蛋白质含量 依法测定(附录Ⅵ B第二法)。 3.1.2生物学活性 3.1.2.1体内法 依法测定(附录Ⅹ B)。 3.1.2.2体外法 按酶联免疫法试剂盒说明书测定。 3.1.3比活性 每1mg蛋白质应不低于1.2×105IU。 3.1.4纯度 3.1.4.1电泳法 依法测定(附录Ⅳ C)。用非还原SDS-聚丙烯酸胶凝胶电泳法,考马斯亮蓝染色,分离胶胶浓度为12.5%.加样量应不低于10μg,经扫描仪扫描,纯度应不低于98.0%。 3.1.4.2高效液相色谱法 依法测定(附录Ⅲ B)。亲水硅胶体积排阻色谱柱.排阻极限300kD,孔径24nm,粒度10μm,直径7.5mm.长30cm;流动相为3.2mmol/L.磷酸氢二钠-1.5mmol/L.磷酸二氢钾-400.4mmol/L氯化钠,pH7.3;上样量20-100μg,于波长280nm处检测,以人促红素色谱峰计算理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算人促红素纯度,应不低于98.0%。 3.1.5分子量 依法测定(附录Ⅳ C)。用还原型SDS-聚丙烯酸胶凝胶电泳法,考马斯亮蓝R250染色,分离胶胶浓度为12.5%,加样量应不低于1μg,分子质量应为36-45kD。 3.1.6紫外光谱扫描 依法测定(附录Ⅱ A),最大吸收峰279nm±2nm;最小吸收峰250nm±2nm;在320-360nm处无吸收峰。 3.1.7等电点 依法测定(附录Ⅳ D),使用pH值为3.0-5.0的两性电解质,等电点应为pH3.3-4.3。 3.1.8唾液酸含量 每1mol人促红素应不低于9.0mol(附录Ⅵ C)。 3.1.9外源性DNA残留量 每1OOOIU人促红素应不高于100pg(附录Ⅸ B)。 3.1.10 CHO细胞蛋白残留量 用双抗体夹心酶联免疫法检测,应不高于0.10%。 3.1.11细菌内毒素检查 每10 000IU人促红素应小于2EU(附录Ⅻ E凝胶限量试验)。 3.1.12牛血清白蛋白残留量 用酶联免疫法检测,应不高于0.01%。 3.1.13肽图(至少每半年测定1次) 供试品经透析、冻干后,用1%碳酸氢按溶液溶解并稀释至1.5mp/ml,依法测定(附录Ⅷ E),其中加人胰蛋白酶(序列分析纯),37℃±0.5℃保温6小时,色谱柱为反相C8柱(25cm×4.6mm,粒度5μm,孔径30nm),往温为45℃±0.5℃;流速为每分钟0.75ml;进样量为20μl;按下表进行梯度洗脱(表中A为0.1%三氯乙酸水溶液,B为0.1%三氟乙酸-80%乙腈水溶液)。 编号 时间/分钟 流速/ml A% B% 1 0.00 0.75 100.0 0.0 2 30.00 0.75 85.0 15.0 3 75.00 0.75 65.0 35.0 4 115.00 0.75 15.0 85.0 5 120.00 0.75 0.0 100.0 6 125.00 0.75 100.0 0.0 7 145.00 0.75 100.0 0.0 肽图应与人促红素对照品一致。 3.1.14N-末端氨基酸序列(至少每年测定1次) 用氨基酸序列分析仪测定。N-末端序列应为: Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asr-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr。 3.2半成品检定 3.2.1细菌内毒素检查 每1000IU人促红素应小于2EU(附录Ⅻ E凝胶限量试验)。 3.2.2无菌检查 依法检查(附录Ⅻ A),应符合规定。 3.3成品检定 陈复溶时间和水分测定外,应按标示量加入灭菌注射用水,复溶后进行其余各项检定。 3.3.1鉴别试验 按免疫印迹法(附录Ⅷ A)或免疫斑点法(附录Ⅷ B)测定,应为阳性。 3.3.2物理检查 3.3.2.1外观 应为白色疏松体,复溶后为无色澄明液体。 3.3.2.2复溶时间 加入标示量的灭菌注射用水,复溶时间应不超过2分钟。 3.3.2.3可见异物 依法检查(附录Ⅴ B),应符合规定。 3.3.2.4装量差异 按附录Ⅰ A中装量差异项进行,应符合规定。 3.3.3化学检定 3.3.3.1水分 应不高于3.0%(附录Ⅶ D)。 3.3.3.2 pH值 应为6.4-7.4或5.4-6.4(附录Ⅴ A)。 3.3.3.3钠离子含量 应不大于190mmol/L(附录Ⅶ J)。 3.3.3.4枸橼酸离子含量 应不大于25mmol/L(附录Ⅶ H第二法)。 3.3.3.5蛋白质含量 依法测定(附录Ⅵ B第二法),应符合经批准的蛋白质含量范围。 3.3.4生物学活性 3.3.4.1体外法 按酶联免疫法试剂盒说明书测定供试品体外活性IU/ml),根据标示装量计算供试品生物学活性(IU/瓶),应为标示量的80%-120%。 3.3.4.2体内法 拉附录Ⅹ B测定供试品体内活性(IU/ml),根据标示装量计算供试品生物学活性(IU/瓶),应为标示量的80%-140%。 3.3.5无菌检查 依法检查(附录Ⅻ A),应符合规定。 3.3.6细菌内毒素检查 每1000IU人促红素应小于2EU(附录Ⅻ E凝胶限量试验)。 3.3.7异常毒性检查 依法检查(附录Ⅻ F小鼠试验法),应符合规定。4保存、运输及有效期 于8℃以下避光保存和运输。自分装之日起,按批准的有效期执行。5使用说明应符合“生物制品包装规程”规定。
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