SFDA-手性药物质量控制研究技术指导原则 (上)

手性药物质量控制研究技术指导原则

一、概述

三维结构的物体所具有的与其镜像的平面形状完全一致，但在三维空间中不能完全重叠的性质，正如人的左右手之间的关系，称之为手性。具有手性的化合物即称为手性化合物。手性是自然界的一种基本属性，组成生物体的很多基本结构单元都具有手性，如组成蛋白质的手性氨基酸除少数例外，大都是L-氨基酸；组成多糖和核酸的天然单糖也大都是D构型。作为调节人类的相关生命活动而起到治疗作用的药物，如果在参与体内生理过程时涉及到手性分子或手性环境，则不同的立体异构体所产生的生物活性就可能不同。手性化合物除了通常所说的含手性中心的化合物外，还包括含有手性轴、手性平面、手性螺旋等因素的化合物。在本指导原则中所指的手性药物主要是指含手性中心的药物，其它类型的手性药物也可参考本指导原则的基本要求。

手性药物是指分子结构中含有手性中心（也叫不对称中心）的药物，它包括单一的立体异构体、两个以上（含两个）立体异构体的不等量的混合物以及外消旋体。不同构型的立体异构体的生物活性也可能不同，大致可分为以下几种情况^【1】：

1）药物的生物活性完全或主要由其中的一个对映体产生。如S-萘普生在体外试验的镇痛作用比其R异构体强35倍。

2）两个对映体具有完全相反的生物活性。如新型苯哌啶类镇痛药-哌西那朵的右旋异构体为阿片受体的激动剂，而其左旋体则为阿片受体的拮抗剂。

3）一个对映体有严重的毒副作用。如驱虫药四咪唑的呕吐副作用是由其右旋体产生的。

4）两个对映体的生物活性不同，但合并用药有利。如降压药-萘必洛尔的右旋体为β-受体阻滞剂，而左旋体能降低外周血管的阻力，并对心脏有保护作用；抗高血压药物茚达立酮^【2】的R异构体具有利尿作用，但有增加血中尿酸的副作用，而S异构体却有促进尿酸排泄的作用，可有效降低R异构体的副作用，两者合用有利。进一步的研究表明，S与R异构体的比例为1:4或1:8时治疗效果最好。

5）两个对映体具有完全相同的生物活性^【3】。如普罗帕酮的两个对映体都具有相同的抗心率失常作用。

正是由于手性药物的不同立体异构体在药效、药代及毒理等方面都可能存在差异，美国FDA在其关于开发立体异构体新药的政策^【4】中要求在对手性药物进行药理毒理研究时，应分别获得该药物的各立体异构体，进行必要的比较研究，以确定拟进一步开发的药物。所以手性药物药学研究的主要任务就是为药物的筛选与进一步研究提供足够数量与纯度的立体异构体。本指导原则是在一般化学药物药学指导原则的基础上，并充分考虑手性药物的特殊性而起草的，其目的是为手性药物的药学研究提供一般性的指导。本指导原则中所说的手性药物主要针对单一的立体异构体、两个以上（含两个）立体异构体组成的不等量混合物。

由于手性药物的研发是一项探索性很强的工作，情况也比较复杂，所以在使用本指导原则时，还应具体问题具体分析：在遵循药品研发的自身规律以及手性药物一般要求的基础上，根据所研制药物的特点，进行针对性的研究。如采用本指导原则以外的研究手段与方法，则该方法或手段的科学性和可行性必须经过必要的验证。

二、手性药物药学研究的基本思路

手性药物药学研究的基本思路为：除了要遵循已有的各项药学研究指导原则外，还需要针对手性药物的特点进行研究。各项研究的具体要求如下：在原料药制备工艺研究时，应根据手性中心的引入方式，采取有效的过程控制手段，严格控制手性原料与每步反应产物的光学纯度；在结构确证时，需根据化合物本身的结构特点，并结合其制备工艺、结构确证用对照品及文献数据等已有的研究基础，选择合适的方式来证明该药物的绝对构型；在选择制剂的剂型、处方与工艺时，应注意保持手性药物构型的稳定，不产生构型变化；质量研究时，应结合工艺与各手性中心的稳定性确定需研究控制的立体异构体杂质，并注意验证各种手性分析方法的立体专属性；在制订质量标准时，应综合各方面的研究数据，合理有效地监控产品的光学特性与光学纯度；在稳定性研究时，应设立灵敏、立体专属性的光学纯度检测指标，以监测构型的稳定性。

各项药学研究之间也是紧密联系、相互印证的，需要随时参考其它研究的结果，以使整个药学研究工作更为全面与准确。下面分别论述各药学研究间的关系：

（一）  结构确证研究与原料药制备工艺间的关系

对于通过化学合成制备的手性药物来说，在确证其构型时，应充分利用从制备工艺中所获取的信息，为结构确证提供必要线索，从而使结构确证研究更容易进行。当原料药中的某一个手性中心是从起始原料或试剂中引入的，并且在后续的反应过程中，该手性中心并未受到影响，或对手性中心构型的影响是明确而定量发生的，此时，如果该起始原料或试剂的立体结构是已知的，根据已知的原材料立体结构及相关的制备工艺，通过经典的化学相关法即可确证原料药中该手性中心的构型。

在鉴定立体异构体杂质的结构时，也可以结合制备工艺中各步反应的机理与可能的副反应来综合分析，确定杂质的可能结构范围后，再选择针对性强的结构确证方法加以验证，以减少杂质结构确证研究的工作量，降低其难度。

分析确定了在工艺中产生的立体异构体或其它杂质的结构后，还可以帮助我们进一步了解反应的机理，优化工艺条件，尽量减少反应副产物的生成。所以杂质的结构确证反过来又可以指导工艺的优化。

（二）  质量研究及标准制订与其它研究间的关系

1.        与制备工艺间的关系

质量研究时应结合制备工艺，分析工艺中可能产生的手性杂质，确定须在质量研究中分析检测的目标杂质，然后根据这些杂质是属于非对映异构体还是对映异构体，选取合适的分析方法，并且有针对性地对这些杂质的检测方法进行验证。

质量标准的控制必须与原材料的源头控制及生产的过程控制相结合才能切实控制上市产品的质量，尤其对于含多个手性中心的药物更是如此。因为立体异构体的数量与手性中心的数目成指数关系，在手性中心较多（一般大于或等于3）时，仅通过终产品的质量标准来控制所有的立体异构体杂质，在技术上有一定的难度，有时甚至做不到。这时一定要根据工艺中手性中心的引入方式，合并采用源头控制及生产的过程控制，来全面控制产品的光学纯度。这样既能有效地控制产品的光学纯度，又能合理地降低终产品质控的难度。

其次，通过了解制备工艺，可以帮助我们全面掌握产品的质量控制情况，分析可能产生的工艺杂质，从而在标准中进行合理的控制。对于手性药物来说，我们可以通过了解手性中心的引入方式，分析各种手性杂质产生的可能性，在采用科学合理的分析方法获取足够数据的基础上，才能明确在质量标准中需控制的各种立体异构体杂质。

2.        与稳定性研究间的关系

首先，质量研究应对稳定性研究中采用的手性分析方法进行全面的验证工作，以保证分析方法的立体专属性。其次，根据稳定性研究中手性杂质的变化情况，判断手性药物的构型在各种环境因素的影响下，以及放置过程中是否稳定，是否有构型变化现象的产生，从而确定是否需在质量标准中控制这些手性杂质。

三、原料药的制备

单一的立体异构体的制备方式主要有两种：一是在动植物体内天然生成或生物转化产生的，再通过分离提取得到；二是合成或半合成的方式，其中也包括某一步或几步反应采用生物催化方式。由于第一种方式的机制比较复杂，且除分离提取外，对其工艺的控制与通常情况下所采用的合成的方式不同，故在本节内容中主要针对第二种方式进行阐述，第一种方式也可参考本节的主要原则。

手性药物作为一类特殊的化学药物，对其制备工艺的研究首先需要遵循化学药物制备工艺研究的指导原则，然后才能考虑其特殊性。在进行制备工艺研究时，手性药物的一个特殊点在于：在研究与制备过程中需要随时关注手性中心的变化，并控制其光学纯度。基于手性药物的这一特点，在研究其制备工艺时，应遵循的一个重要原则是：对所有的手性原料与试剂均应控制其光学纯度，引入手性中心后的各反应中间体也应结合反应机理，对可能产生的立体异构体杂质进行有效的分离、控制。这样就能与终产品的质量控制相结合，达到全面控制产品光学纯度的目的。

由于手性中心的引入方式不同，在工艺中控制光学纯度的方式也各有不同，所以下面将根据手性中心的引入方式分别进行阐述：

（一）直接从起始原料或试剂中引入

在此情况下，终产品中的手性中心是从光学纯的起始原料或试剂中引入的，在后续的制备过程中，不再涉及手性中心的构型改变，或涉及到的构型改变是可控的。因此，终产品的光学纯度主要取决于以下两个方面：起始原料或试剂的光学纯度；后续反应过程是否会影响到已有的手性中心，从而产生构型变化的可能性及程度。所以在进行工艺研究时，首先要采用立体专属性的分析方法严格控制起始原料或试剂的光学纯度，制定合理可行的手性杂质的限度。其次要根据后续反应的机理，充分分析后续反应是否会影响已有手性中心的构型，如可能会产生影响时，应研究与优化工艺条件，尽量避免或减少构型变化的产生。

由于在后续反应中存在构型变化的可能性，所以，在制备工艺中仅控制起始原料或试剂的光学纯度是不充分的，尤其是当终产品中存在多个手性中心，且难以对终产品中的所有立体异构体杂质进行有效控制时，就需要结合工艺中的过程控制来综合控制终产品的光学纯度。这就要求在进行工艺研究时，对引入手性中心后的每步反应的中间体中的立体异构体杂质进行检测，分析与监测构型变化的可能性。如没有发生构型变化，则只需根据工艺优化与验证的结果，在制备工艺中严格控制工艺操作参数即可；如可能会发生部分构型变化，则除了需严格控制工艺操作参数外，还需采用可靠的指标对中间体的光学纯度进行控制，即对该步反应中间体中的立体异构体杂质进行严格的控制。

总之，在此种情况下，除了需对手性中心引入的源头——起始原料或试剂进行光学纯度控制外，还需根据终产品质控的难度分别采用上述不同的过程控制方式，以切实控制终产品的光学纯度。

（二）不对称合成

此种情况是指采用立体选择性或专属性的反应（包括酶催化反应）在分子中引入所需构型的手性中心，所以终产品的光学纯度直接取决于该步反应的立体选择性。为保证所采用方法的立体选择性，首先应尽可能查阅相关的文献资料，充分了解所用不对称合成反应的反应机理、反应条件、立体选择性等，以选取合适的反应；其次，在工艺研究中应对该步不对称反应的工艺操作参数进行筛选优化，并对产物的立体异构体进行严格的监测，确定该步反应的工艺条件与反应产物的光学纯度控制指标。引入手性中心后，进行后续反应时仍可能产生构型变化，故同样需要根据终产品质控的难度分别采用不同的过程控制方式，来综合控制终产品的光学纯度。此外，不对称合成中有可能使用一些毒性较大的催化剂，在后处理过程中应注意控制其残留。在质量研究中对这些催化剂的检测方法进行研究与验证，并在质量标准中对其残留量进行控制。

两个以上（含两个）立体异构体组成的不等量混合物的合成主要是通过不完全的立体选择性反应得到的，此时在进行制备工艺研究时，其主要任务是确定合适的工艺参数，保证能稳定地获得组成固定并符合要求的混合物。

（三）消旋体的拆分

此种方式是指采用手性拆分试剂与外消旋的中间体或终产品反应生成非对映异构体，分离纯化得到所需的非对映异构体，再去掉手性拆分试剂，从而得到所需构型的手性化合物。在此工艺中影响终产品的光学纯度的因素有：手性拆分试剂的光学纯度、分离纯化是否完全、拆分及后续反应的构型变化。针对以上影响因素，要控制终产品的光学纯度，可采取以下措施：首先应采用光学纯度尽可能高的拆分试剂；其次，应尽量纯化与拆分试剂反应所得的非对映异构体，因为这是控制成品光学纯度的重要步骤。在这两个措施中，均应采用合适的方法严格控制试剂与产品的光学纯度。

除此之外，随着手性拆分技术的进步，也可以采用制备型的手性色谱技术来直接分离对映异构体，从而得到所需的目标化合物。

总之，在手性药物制备工艺研究中，如果能充分考虑从工艺中对产品的光学纯度进行有效的全程控制，就能从源头上控制产品的质量。尤其是当终产品的质量标准难以全面有效地控制其光学纯度时，就更应该重视制备工艺研究中的过程控制。

四、结构确证

由于手性药物具有立体结构，并且在非手性条件下，对映体一般具有相同的熔点、溶解度、色谱保留行为、红外光谱（Infrared Spectroscopy，IR）、核磁共振谱（Nuclear Magnetic Resonance，NMR），因此手性药物结构确证具有一定的特殊性，在进行结构确证时，除应符合结构确证的一般原则外，还应特别注意对其构型进行研究与确证。

（一）手性药物结构确证的基本原则

手性药物结构确证的总体原则：应注意确证手性药物分子的绝对构型，对各手性中心的绝对构型是R还是S（或其它的绝对构型表示方式）均应确证清楚。对于单一的立体异构体，只需确证该分子中各手性中心的绝对构型；而对于立体异构体的混合物，则需要对各立体异构体的绝对构型及立体异构体间的比例进行确证。

构型的确证方法大体分为两类：直接法与间接法。直接法是指只需通过某一单一的方法即可确证手性药物的构型，例如，单晶X射线衍射法（Single-crystal X-ray Diffraction，SXRD）；间接法是指仅靠对待测物进行分析，尚难以确证其构型，而需综合其它数据，如与其同系物的相关分析数据相结合才能确定待测物的构型。例如，比旋度、手性色谱、核磁共振以及旋光光谱（Optical  Rotatory  Dispersion，ORD）、圆二色谱（Circular Dichroism，CD）等分析方法都属于间接法。化学相关法也属于间接法。

除下面介绍的仪器分析方法外，也可采用化学相关法确证手性药物的构型。在手性药物的制备过程中构型的变化是已知的情况下，根据起始原料的构型、化学合成方法的立体选择性以及各中间体的立体结构也可间接获得最终产品（药物）的构型信息。该方法在仪器分析方法成熟以前使用较多。

在确证手性药物的结构时，可采用常规方法确证药物的结构式；然后再根据手性中心的数量、起始原料的构型、化学合成方法的立体选择性、文献数据、对照品等相关信息，有针对性地选用比旋度测定、手性高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）或气相色谱法（Gas Chromatography，GC）、化学相关法、SXRD、CD、ORD以及奥氏核效应（Nuclear Overhauser  Effect，NOE）差谱等方法对其绝对构型进行确证。因为比旋度测定相对比较简便，且与分子的构型有一定的相关性，所以一般情况下比旋度是必需的检测项目之一。

此外，在绝对构型的确证中，为保证结果的准确性，除采用一种方法外，需考虑采用另一种方法加以确认。

（二）手性药物构型确证的主要方法

下面对手性药物构型确证的主要方法分别进行简要介绍。 

1．X射线衍射法（X-ray Diffraction，XRD）

  由于单晶X射线衍射法可以独立确定分子的绝对构型，所以在其他相关信息比较缺乏的情况下，如要确证手性药物的绝对构型，建议采用单晶X射线衍射法。

  单晶X射线衍射法是通过单色X光源，常用CuK_α(1.54178Å)与MoK_α（0.71073Å）对具有一定几何尺寸大小（0.01-1.00 mm）的药物单晶体样品（由多个晶胞组成）进行X射线衍射实验，记录衍射数据并经相位计算即可获得药物分子立体结构的相关定量信息，如药物分子的相对或绝对构型以及药物晶体中存在的结晶水/溶剂含量与位置等一系列信息。

通常可采用四圆衍射仪（低功率光源）、CCD衍射仪（低功率光源）或IP面探测仪（高功率光源）进行手性药物分子构型的测定。

单晶X射线衍射法测定分子绝对构型包括直接与间接两种方法：

直接法：其测定原理是应用不同化学元素对X射线的反常散射（色散）效应。若待测药物样品仅含有C、H、N、O元素时，应使用CuK_α辐射，衍射实验的θ角度不低于57^o；若待测样品中含有原子序数大于10的元素时，可以应用MoK_α辐射，衍射实验的θ角不低于25^o。

间接法：利用分子结构中部分已知构型的基团确定分子构型。衍射实验采用CuK_α或MoK_α辐射均可。

应注意的是：由于单晶X射线衍射结构分析的对象仅为待测样品中的一颗晶体，样品缺少普遍性，需对药物样品进行粉末X射线衍射（Powder X-ray Diffraction，PXRD）实验，用单晶结构数据计算该构型手性药物的理论粉末X射线衍射图谱，并与实验粉末X射线衍射图谱比较，当二者一致时即可证明衍射用单晶具有普遍性，从而确定手性药物的构型。

2．圆二色谱

该项测试的原理主要是通过测定光学活性物质（待测物）在圆偏振光下的Cotton效应，根据Cotton效应的符号获得药物结构中发色团周围环境的立体化学信息，并与一个绝对构型已知的与待测药物结构相似化合物的