荧光定量PCR全攻略

上一篇 / 下一篇 2008-04-09 10:09:37

荧光定量PCR检测技术从诞生到现在已经有 8 年了，但是其应用在近四年才迅猛增长。在 Medline 数据庫中，用“ Taqman” 或 ”real time PCR” 作为关键词检索，在1996 年仅有 19 篇，在 1997 年仅有 28 篇，在 98 、 99 、2000 年分别达到了 52 、 157 、 409 篇， 2003 年已经达到2984 篇，相信在不久的将来会有更多的文章发表。针对实时 PCR 这一热点领域，闪晶公司对它进行了深入细致的研究，并且及时地为广大科研人员推出这项技术服务。

荧光定量PCR基本原理

• Taqman 技术：该技术以美国 ABI 公司为代表。 PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， PCR 仪检测不到荧光信号； PCR 扩增时（在延伸阶段）， Taq 酶的 5'' － 3'' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。

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• Beacon 技术：该技术以美国人 Tagyi 为代表。也是加入了荧光探针，但它是环状的寡核苷酸探针，分别由茎部和环部组成，两端分别标记荧光报告基团和荧光猝灭基团，在无靶序列的情况下，探针始终是环状，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭，使荧光检测仪检测不到荧光信号；而在有靶序列时，即在 PCR 的退火阶段探针与靶序列结合，使荧光报告基团和猝灭基团分开，这样荧光仪可以检测到荧光，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。

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• FRET 技术：该技术以 Roche 罗氏公司为代表。它的基本原理是：两条直线型寡核苷酸探针，其中一条的 3 ‘端标记荧光激发基团，另一条的 5 '' 端标记荧光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行能量的传递，这样荧光仪不能检测到荧光信号；而当有靶序列时，即在 PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合，使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以检测到荧光信号，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。

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实时荧光定量PCR中的几个俗语

• Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。（如图所示）

• 荧光域值（ threshold ）：是指 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号，荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍，即： threshold

• Ct 值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔 1 〕，起始拷贝数越多， Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代 Ct 值（如图 2 所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光定量PCR应用广泛

• 可以对各种基因的表达进行定量分析，如：同一基因在不同组织中的表达差异、同一基因在不同药物处理后的表达差异、转基因食品的检测。过去最常用的高通量筛选基因表达差异的技术是 cDNA 芯片和差异显示，但这两种技术的缺点是只能定性而非完整意义上的定量分析。实时 PCR 技术和高通道实时 PCR 仪的出现，无疑为这种检测提供了极大的方便。

• 可以进行点突变分析和等位基因分析，用不同的荧光报告基团标记 Taqman 探针，然后分别与野生型和突变型杂交，如果一种荧光信号明显强于另一种荧光信号，则表明它是纯合子；如果两种荧光信号都明显增强，则表明它是杂合子。另外分子信标（ Molecular Beacon ）就是专门为这种技术设计的探针。

• 可以进行单核苷酸多态性的分析，检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦 SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。

• 可以进行 DNA 甲基化检测， DNA 甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症， Laird 报道了一种称作 Methylight 的技术，在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman 探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。

• 对传染性疾病进行定量定性分析，这在我国应用比较广泛，大家比较熟悉。许多生产临床 PCR 试剂的厂商已经陆续推出了一系列的诊断试剂，如：肝炎系列、性病系列、肿瘤系列等等。

荧光定量PCR操作程序

1. 根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。

2. 提取 DNA/ RNA 。

3. Real Time PCR荧光定量PCR，进行实验结果分析

4. 实验完成后，提供完整的实验报告（含软件分析结果）及引物等实验材料

MicroRNAmiRNA荧光定量PCR技术服务

一、什么是miRNA?
MicroRNAs miRNAs是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRN As 。

二、miRNA是如何产生的？

ri图一： Micro RNA 的产生

miRNAs 是转录后长片段的 RNA 分子（ pri-miRNA ）的一部分，首先在细胞核内被双链 RNA 特异的核酸酶Drosha 处理成为 70-100 个核苷酸组成的发夹结构 RNA （ pre-miRNA ）。这一发夹结构 RNA 运输到细胞质，被另一个双链 RNA 特异的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 个核苷酸组成的成熟的 miRNA ，结合在与 RNA 介导的沉默复合物（ RISC ）类似或者相同的复合物中，这个复合物参与了 RNA 干扰。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的碱基配对引导 RISC 降解目的片段或是阻碍其翻译过程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互补的碱基配对决定了这个过程的特异性。通过抑制翻译还是降解发挥作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之间的错配程度决定的，匹配程度高的目的 mRNA 将被降解。由于 miRNAs 可以对不完全互补的 mRNA 配对来抑制蛋白质的翻译过程，因而每个 miRNA 可以有多个靶基因，而几个 miRNAs 可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个 miRNA 来经济地调控多个基因的表达，也可以通过几个 miRNAs 的组合来精细调控某个基因的表达。对于基于 miRNA 调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。

三、miRNA荧光定量PCR基本原理
实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。但是就成熟的microRNA而言，由于其是由21-25个核苷酸组成的小RNA，长度太短，并不能通过传统的实时定量PCR进行检测,但是通过特殊设计的茎环结构的反转录引物，配合实时定量PCR引物及探针可以精确检测微量样品中microRNA表达水平，也可以用终点PCR法定性检测。