可提高核磁共振谱图数据灵敏度的微线圈探针

摘要：核磁共振（NMR）是化学家们对化合物进行结构鉴定时所用的最有力的工具之一，但其最大的缺陷就是灵敏度低。研究人员为此发展了许多方法来克服这一弊端，并已经取得了一些进展。然而，这些方法中的绝大部分都依赖于昂贵的仪器设备或配件。本文介绍了一种可以在不显著增加系统成本基础上提高灵敏度的微线圈技术。

Abstract：NMR spectroscopy is one of the most powerful techniques in the chemist’s toolbox for structure determination, but its most significant disadvantage is its low sensitivity. Many approaches have been developed to overcome this drawback of NMR, and advances in sensitivity have been achieved. However, most have involved the installation of expensive instrumentation or accessories. This paper describes the use of microcoil technology, which improves sensitivity without a substantial increase in the cost of the system.

    核磁共振（NMR）是一种强有力的分析方法，常用于提供化合物的结构信息及其他化学属性，如样品的成分。它的应用结果常用于反应动力学的研究。尽管NMR能提供大量的信息，但它的检测灵敏度却比其他分析检测方法（如质谱或紫外检测）低几个数量级。人们已发展了许多方法来提高N MR检测的信噪比（S/N），例如使用高强磁场和低温冷冻探针。这些方法的确改善了信噪比，但同时也显著提高了仪器价格。提高检测灵敏度的另一个方法就是增大样品的体积，但这对于许多很难获得大量样品的研究，尤其是感兴趣的生物分子的研究，是不可行的。近年来，微线圈技术的应用可以显著提高NMR 的检测灵敏度，而成本却比低温冷冻探针低很多^[1］。

　　将样品放入到微线圈探针是一个与提高检测灵敏度密切相关的重要问题。必须对所有因素进行优化，以便使系统的通量最大化，并且适合分析者的使用。许多设备使用了高通量的自动进样器，而其他设备中则采用了色谱或电泳分离方法。因而需要建立一种完美衔接的分析方法来优化分析实验室的通量。

　　本文介绍了通过微线圈技术来提高NMR检测灵敏度的方法。讨论了包括微流注射、固相萃取（SPE）、HPLC、电迁移等许多样品处理方法。

1 应用微线圈优化用于微克和亚微克级质量分析的NMR灵敏度

　　一般地，射频（RF）接受器线圈应与样品完全吻合以确保检测灵敏度高。一个设计合理的NMR探针可以使观测因子和填充因子均最大化。观测因子是指RF线圈观测到的样品体积与分析所需的总样品体积的比值；填充因子是指RF线圈观测到的样品体积与线圈体积的比值。由于线圈的灵敏度与其大小成反比，因此一个使用1mm RF线圈的探针会比一个使用将近10mm RF线圈的常规探针的质量灵敏度提高十多倍。由于尺寸小，而且是与磁化率匹配的专利化方法，商品化的CapNMR^TM微线圈探针（Protasis，Inc.，Marlboro，MA）易于使用，而且只需要一些易获得的系统夹片即可以满足分辨规格。关于微线圈N M R 设计的详情可参见参考文献^[1］。

　　图1 是一个微线圈应用的例子。它给出了分别应用CapNMR探针和低温冷冻探针对一个未知样品进行分析的NMR谱图。尽管两个图谱中S/N 是一样的，但由于质量检测时所用的溶剂体积相差100倍， 因此用CapNMR探针得到的图谱的背景噪声实际上相当小。

2 微线圈用于获得生物分子样品的NMR 数据

　　因为获得大量蛋白质（或其他大分子）样品是非常困难或麻烦的，因此应用微线圈来采集生物分子的NMR图谱数据具有明显优势。最近，Peti等^[2]利用TXI HCNz-grad CapNMR探针来确定蛋白质折叠和一个10kD蛋白质( Thermotoga maritima的TM0979)序列特异性的骨架分布。这种探针非常适合获得从未经优化的、高度自动化的蛋白质表达链上生产的蛋白质样品的NMR图谱，而采用这种方法获得的蛋白质的量不足以用传统的5-mm探针NMR进行分析。该探针为结构蛋白质组计划中研究蛋白质折叠开辟了一条崭新的道路。

　　Peti 及同事们应用基于CapNMR探针的异核三重共振HNCA和HNCOCA实验确定了序列特异性的骨架分布。研究组在HCCH-TOCSY实验中，第一次证实了在脂肪区和芳香区之间的TOCSY转移。该实验正是由于CapNMR探针需求的能量低、质量灵敏度高而得以进行。由于RF能量的限制，该实验在其他更大的探针上是不可能实现的。

3 自动化和样品处理

　　对许多需要通过自动进样器不断向NMR探针送入大量样品的实验室而言，高通量是一个日益严峻的问题。每个样品的总时间是一个关键问题，它取决于样品在探针中的停留时间以及样品的制备和输送。当使用微线圈时，检测的灵敏度提高，因此获得数据所需的样品停留时间就会减少。此外，还可以通过优化样品制备和输送过程来缩短时间。

　　在NMR流动注射体系中最广泛使用的NMR 自动系统是215型液体处理器（Gilson，Middleton，WI）。Protasis 和MRM（Savoy，IL）将这种液体处理器与一个高压HPLC梯度泵结合使用，开发了一种适用于CapNMR探针的上样方法。该技术已被许多大制药公司用来改造适合CapNMR探针的流动NMR系统。

　　GlaxoSmithKline（Research Triangle Park，NC）的科学家们通过引入可显著改善出错平均时间的过滤器维护方法促进了该技术的发展，实现了在不更换过滤器的情况下可以进行上千个样品的无错进样。其研究中所使用的Inova600 兆赫NMR仪的系统（Varian，Palo Alto，CA）包括一个特殊的针头（Gilson）、加载端口（Protasis/MRM）、过滤器和CapNMR探针。图2 所示为从96孔板采集得到的图谱。这种毛细管流动自动化系统需要相当少的样品和溶剂，提供更短的系统休整时间和更小的溶剂保留峰。

　　Open Access Automation NMR系统（Protasis/MRM）由一个用以控制CTC自动进样器（Leap Technologies, Carrboro, NC）的用户界面和NMR 组成。它能够和所有商品化的NMR仪配套使用，并能提供一个包括样品控制、报告管理和信息说明在内的以使用者为中心的系统视图。其液体处理器是针对微升体积样品而特殊设计的。

4 色谱和电泳分离与微线圈NMR检测的联用

　　由于能够给分析人员提供重要的结构信息，因此NMR通常被用作某些分离技术（如HPLC和电泳分离、固相萃取）的检测器。在与这些分析工具联用时，CapNMR探针尤其有用。这是因为探针体积（约5－10μL）与洗脱峰的体积相匹配，能为检测提供一个宽的动态范围，从而可以使研究人员获得窄峰，检测到与利用标准探针相比更小的样品量。相反，当使用标准探针时，探针的动态范围与洗脱峰的体积不匹配，就需要更多的样品量。下面部分将介绍微线圈NMR与分离技术联用的典型应用。

4.1 HPLC

　　在近期的研究中，人们实现了Inova 500兆赫NMR系统和带有二极管阵列检测器（其用于检测洗脱时感兴趣的峰，然后通过NM R 对峰进行断流检测）的CapLC毛细管HPLC系统（Waters Corp.，Milford，MA）的联用。带有1.1 μL 流动池体积、实验室自制微线圈探针的N M R 能够通过氢谱对毛细管HPLC分离的母育酚、α -生育酚、β -生育酚、γ -生育酚、δ -生育酚及α -生育酚醋酸盐进行连续监测和及时鉴定。样品中每种感兴趣的化合物的量可以少至1.33μg。该系统可以对纳克级样品（如37 ng的α－蒎烯）提供有用的图谱（图3）^[3］。此外，采用断流技术能够对α - 生育酚的2-D1H1H，COSY NMR谱图进行结构确认。
 

　　CapLC系统能被设置进行自动化的毛细管SPE。与色谱柱不同，SPE柱可被及时地反复洗脱。一旦洗脱时间被确定，CapLC可经设置进行重复操作。确定停流时间后，可触发NMR的控制台来获取数据。毛细管SPE-CapNMR的另一个优点是溶剂保留峰相对较小。这是因为与带有大体流动池的探针相比，CapNMR探针可产生更小的溶剂背景信号。高通量和96孔板SPE形式用于微流进样目前正处于研究阶段中。

5 结论

　　带有微线圈的NMR可以显著提高系统检测灵敏度。与标准探针比较，可获得更少量样品的数据。当获得样品花费时间多、精力大时（比如进行杂质分析、降解研究、代谢物及天然产物研究），检测灵敏度的提高非常重要。由于可以使用更少量的样品，分析人员不必提取得到更多样品。当使用多孔板时，可对有限的样品进行多次分析。

参考文献：

1. Lacey ME, Subramanian R, Olson DL , Webb AG, Sweedler JV. Chem Rev，1999;99:3133-52.
   
2. Peti W, Norcross J, Eldridge G, O＇Neil-Johnson M.J Amer Chem Soc 2004;126:5873-8.
   
3. Lacey ME, Tan ZJ,Webb AG, Sweedler JV.J Chromatogr A，2001;922:139-49.
   
4. Koegler W, Ivory C.J Chromatogr A，1996 ;229:229-36.
   
5. Greenlee R, Ivory C. Biotechnol Progr, 1998;14:300-8.
   
6. Huang Z, Ivory C. Anal Chem，1999 ;71:1628-32.