动态预涂层在CE 联用技术中的应用

摘要：毛细管电泳与传统分离方法相比，具有分析时间短、分辨率高、样品/缓冲液用量少、易于自动化、功能多样性等优点。尽管如此，毛细管电泳在分析领域仍未能展现出全部的潜力。这是由于在大多数要求比较苛刻的实际应用中，毛细管电泳难以获得较高的重现性。本文对该问题进行了阐述，并提出了一个很有前途的解决方法。

Dynamic Precoatings for Hyphenated CE Applications

William W.P. Chang, Christine Hobson, David C. Bomberger, and Luke V. Schneider

Abstract: The advantages of capillary electrophoresis over traditional chromatographic separation methods include short analysis time, high resolution, low consumptionof reagents and analyte, ease of automation, and multiplexing capability. Despite these advantages, the method has not achieved its full potential in the analytical community because of the difficulty in achieving the high reproducibility needed in the most demanding applications. This paper addresses this issue and presents a promising solution.

        毛细管电泳（CE）与传统的分离方法相比，具有分析时间短、分辨率高、样品/ 缓冲液用量少、易于自动化等优点。尽管如此，与一些具有竞争性的分离技术，如液相色谱(LC) 或凝胶电泳相比，CE 并没有得到广泛的应用。产生这种现象的原因有很多，其中最主要的是由于电渗流（EOF）的改变导致毛细管电泳方法很难获得较高的重现性。这不仅限制了分离范围，而且也会导致分辨率的降低^[1]。

        关于EOF 的控制方法已有很多的报道^[2]。主要是通过共价修饰管壁，或者在运行缓冲液中加入添加剂进行动态改性的方法，来屏蔽或者改变毛细管壁上的负电荷。毛细管的共价改性对调节EO F 非常有效。但是，随着使用时间的增长，尤其是在使用碱性pH 分离缓冲液进行分离时，共价涂层会逐渐被破坏。对于商品化的共价改性毛细管来说，最大的问题是涂层的均匀性和重现性。有报道说，不同公司制作的改性毛细管在各个批次之间和同一批次内部的重现性很差^[2]。毛细管内涂层不均会导致明显的峰展宽和分辨率的下降^[2]。

        作者先前报道过一种用于控制EOF 的有效方法，即使用EOTrol^TM 组分（Target Discovery, Inc., Palo Alto, CA）进行动态改性^[2]。由于EOTrol 是加入到分离缓冲液中的，这使得整个毛细管内的涂层随着时间的延长变得非常均匀。EOTrol 动态改性对于pH 和缓冲液均不敏感，因而允许用户在阴极（正向）或者阳极（反向）选择不同程度的EOF。

        本文介绍了一种与EOF 控制相关的预涂层材料-- UltraTrol^TM。这类新材料保留了EOTrol 最初的特点，但它是在分离之前进行毛细管涂层，而不需要加到分离缓冲液中。这就使CE 的联用技术，如毛细管电泳- 质谱(CE-MS)和CE-nanoLC 等变得更为简单，同时也有利于采用更宽范围的检测技术，如低紫外检测和电化学检测。

1 实验

        所有试剂均购自Sigma-A ldrich (St. Louis, MO)。石英毛细管购自Supelco (Bellefonte, PA)。使用的毛细管全长60.2cm，有效长度（从进样端到检测器）50cm，内径100μm。未涂层的石英毛细管依次用甲醇、1mol/L HCl 和1 mol/L N aO H 进行预处理。每次更换溶剂前均用水冲洗。每个冲洗步骤均在138 kPa (20psi ) 下进行。

        所有的CE 实验均在P/ACE MDQ 毛细管电泳系统（Beckman-Coulter Instruments, Inc.,Fullerton, CA）上进行。实验运行时，用冷凝液将柱温保持在25℃。表1 给出了所使用的每种缓冲液的成分。当采用相同的U ltraTrol 但在不同pH 条件下运行时，毛细管均要在依次用1 mol/L NaOH 和水在138 kPa (20 psi) 的压力下冲洗2 min 后，再用UltraTrol 预涂层。当实验使用不同的U ltra Trol 配方时，毛细管要先用1 mol/L NaOH 冲洗10 min，然后再用水冲洗2 min。

2 EOF 的测量

        先用UltraTrol 溶液在138 kPa 压力下冲洗经过预处理的毛细管2 min， 再用分离缓冲液冲洗2 min。然后再测量经UltraTrol 处理过的毛细管的EOF。将含有10 μg/mL 中性EOF 标记物（p- 硝基苯基-N- 乙酰基氨基葡糖苷）的运行缓冲液在3.45 kPa (0.5 psi)的压力下进样5 s，然后检测EOF 标记物。对表1 中每种20 mmol/L 电泳缓冲液的EOF 均进行了测量。

3 涂层稳定性的测量

        采用表1 中每种20 mmol/L 电泳缓冲液，通过两种不同的方法，测定了UltraTrol 配方的寿命。对于UltraTrol LN，测量了1,3,6- 三磺酸萘阴离子试剂的表观迁移率。选择这种阴离子试剂是由于它具有较高的内在迁移率，能够在60 min 的电泳时间里反复地测量，而对于中性EOF 标记物仅能测量1~2 次。对于UltraTrol HN 和HR，单个批次涂层的稳定性可以通过连续测量中性EOF 标记物来确定。对于每种UltraTrol 配方（HR，HN 和LN），3 个不同批次的涂层稳定性也可以通过中性EOF 标记物在起始时间点和第2 时间点（运行60 min 后）进行测定。

        测量时先用一种UltraTrol 溶液在138kPa 压力下冲洗2min，再用电泳缓冲液冲洗2 min。将含有阴性或者中性EOF 标记物的缓冲液（阴性EOF 标记物的质量浓度为0.1mg/mL，中性EOF 标记物的质量浓度为10 μg/mL）在3.45 kPa 压力下进样5s。运行一段时间后，再进另一个样品。连续进样的时间间隔大约为1h。每种UltraTrol 间隔时间要足够长，以免干扰前一个样品的检测。

4 结果

4.1 稳定可控的EOF

        上述3 种UltraTrol 配方的初始EOF 与pH 的关系如图1 所示。在pH 3~9 的范围内，3 种配方的EOF 对pH 值不敏感。UltraTrol LN 的EOF 在pH 3 时检测不到，直到pH 4 才能测到。这些结果与以前报道的动态涂层EOTrol 结果非常相似^[2]，在统计学上与EOTrol 在同样缓冲液条件下测得的EOF 没有什么区别。误差条显示每种UltraTrol 配方的3 个不同批次之间存在标准偏差。与EOTrol 相同，用1 mol/L NaOH 冲洗2 min，可以很容易地除去UltraTrol 涂层。因为在同一根毛细管上可能开展具有不同EOF 的应用，易于除去涂层的特性非常利于自动操作。

4.2 涂层的稳定性

        测定了表1 中每种缓冲液条件下的涂层稳定性。为了简化数据，图2 给出了每种UltraTrol 在单一pH 值下的测量结果。可以看到，在不同缓冲液条件下， 涂层的稳定性相近（相关数据可以从以下公司网站得到：www.targetdiscovery. com ^[3]）。在所测的pH 条件下，UltraTrol HR 的EOF 在60 min 内的变化小于2％（只有pH 7.2 时的变化是7％），低于U ltra Trol 的批次间变化(10%)。同样，在所有pH 值下，UltraTrol HN 在60 min 内EO F 的变化小于2％，低于其批次间的变化。UltraTrol LN 的EOF 在60 min 内的改变小于1 ％，也明显低于其批次间的变化。在没有随时增补UltraTrol LN 预涂层的情况下，阴离子EOF 标记物表观迁移率在60 min 内的变化在pH 9 时小于5％（改变最大），在pH 7.2 时小于2％（见图3 ）。图3 显示了在石英毛细管裸柱中国实验室上阴离子标记物的表观迁移率，从中可以看出涂层前后的变化。由于UltraTrol 易于被1 mol/L NaOH 洗脱，所以U ltra Trol 预涂层在高pH（如pH 11）条件下不稳定，只能在电泳运行开始前进行涂层。

4.3 CE-MS 和其他CE 的联用方法

        对于在线CE-MS，关键是CE 流出物中不能含有抑制电离的物质。尽管含在电泳缓冲液中的EOTrol 在MS 中难以电离，但是当它被用来预涂层时，在随后的分析中，最终流出物中即使有，也只是非常少的UltraTrol。为了证明UltraTrol 预涂层在MS 中不会抑制离子化，作者用UltraTrol 对石英毛细管裸柱进行了预涂层。用水冲洗毛细管后，将溶于5 mmol/L 醋酸铵（pH 7）的10 μmol/L 缓激肽充入毛细管中，然后用压力将缓激肽溶液推到收集管中，用Mariner ESI TOF MS （ABI，Foster City, CA）进行测定。将通过UltraTrol 预涂层毛细管收集的样品与通过毛细管裸柱收集的样品进行比较，可以看出经UltraTrol 涂层后，样品没有离子抑制现象（见图4）。在上述对照实验中，样品的进样体积（4.7 μL）都是根据毛细管的尺寸计算的。两种样品都是经过稀释和同样处理后，再进行M S 分析。

4.4 低紫外吸收性能

        已经有人证明EOTrol 在205 nm 处没有紫外吸收^[2]，但在大约240 nm 处会有一定的背景吸收。由于UltraTrol 不加入到分离缓冲液中，所以除了在检测窗口处的UltraTrol 会有少量的紫外吸收外，背景吸收没有显著增加。直至190 nm，UltraTrol 还不会产生系统峰或是干扰检测。

5 总结

        UltraTrol 动态改性可以提供稳定、重现的、并对pH 不敏感的EOF 。与作者以前报道的EOTrol 动态涂层相似，采用UltraTrol 可以选择性地产生正向（阴极）或反向（阳极）的EOF。因为UltraTrol 只用于预涂层，不会污染洗脱出的样品，从而确保了CE 的联用技术（如CEMS 和CE-nanoLC）可行。此外，它也不会干扰其他检测方法（如电化学检测、示差折光检测和旋光检测等）。由于只有微量的U ltraTrol 黏附在检测窗口上，所以不会直接或间接地干扰低波长下的紫外检测，也不会产生假的系统峰。在电泳运行1h 内，涂层性能不会发生显著的变化。然而，由于UltraTrol 是一种预涂层材料，所以EOF 的精确性和性能的稳定性会受到缓冲液种类和添加剂的影响。

参考文献：

1. Herr AE, Molho JI, Santiago JG, Mungal MG, Kenny TW, Garguilo MG. Electroosmotic capillary flow with nonuniform. zeta potential. Anal Chem 2000; 72:1053-7.
2. Chang WP, Nichols L, Jiang K, Schneider LV. Dynamic coatings for selectable buffer-insensitive
   electroosmosis. Am Lab News 2004; 36 (2):8-13.
3. EOTrolTM product technical guide. Target Discovery, Inc., Palo Alto, CA, 2004; www.targetdiscovery.com/index.php?topic= prod.eotr.