人神经生长因子基因在酵母中的表达研究

神经生长因子（Nerve Growth Factor,NGF)是一种由118个氨基组成的蛋白质，是神经科学领域中最引人注目的课题之一。但是由于NGF3个链内二硫键影响折叠的原因，用传统的基因工程方法获得大量rhNGF有相当的困难。研究发现，将hNGF蛋白在毕赤酵母表达系统中进行外泌表达，克服了rhNGF无天然活性的问题，表达产物分泌于胞外有利于下游的纯化。该研究为rhNGF规模生产和临床应用打下良好基础，也为同类产品的研发提供了技术平台，有利于其它难表达基因产品的制备开发。

毕赤酵母Pichia pastoris目前已是仅次于大肠杆菌的最常用蛋白表达系统，广泛应用于实验室规模的蛋白质制备、表征以及结构解析等方面，目前已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到成功地表达。美迪西科研人员建立了成熟的酵母表达纯化服务平台，提供优质的重组蛋白在毕赤酵母和酿酒酵母中的表达与纯化服务。

目前NGF在临床上试用于治疗周围神经损伤、糖尿病性周围神经病变、化学试剂或药物引起的神经中毒等神经系统疾病，疗效显著，是迄今唯一可能应用于临床治疗的神经系统蛋白质因子，而且在一些肿瘤中NGF及其受体常有高浓度表达。美国在应用基因工程的方法生产rhNGF方面已取得很大进展，可是他们在临床适应证的研究上颇费周折。最近，我国SDA批准了鼠源NGF上市，用于治疗化学中毒引起的神经疾病；但基因工程方法生产rhNGF还未取得突破。我国有研究者尝试了将人神经生长因子基因在酵母中的表达。

1、材料和方法

（1）菌株

通过全基因合成得到人神经生长因子（hNGF）的全基因片断，将该基因片段插入到含有AOX1启动子和分泌信号肽序列的载体pPIC9K中，构建了重组表达质粒pPIC9K/rhNGF，转化Pichia pastoris GS115宿主菌。

通过比较转化子在培养基MM和MD平板上的生长状况，筛选His+ Mut+表型转化子，并在2.0 mg/mL G418平板上筛选得到多拷贝转化子。摇瓶培养，甲醇诱导外源基因表达，表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明重组蛋白质相对分子质量13.6×103，能与特异性抗体发生免疫反应；鸡胚背神经节法测rhNGF活性，结果显示表达活性可达104 U/mL。

（2）方法

蛋白表达条件的优化根据影响酵母表达的各种关键因素，设计了正交试验选择表达条件。　工程菌的发酵培养及蛋白表达取液氮保存甘油管菌株，取适量无菌操作涂布于YPD平板上，30℃条件下倒置培养活化24 h。取活化平板上3～5个单菌落，接于BMG摇瓶，30℃，200 r/min摇床培养24h。以0.5％比例转接入二级BMG培养基，30℃摇床200 r/min培养24 h，当菌密度达1.0～1.3时，以10％比例接于有BMG培养基的发酵罐中，30℃条件下发酵培养，溶氧（dissolved oxggen, DO）控制在30％，pH为6.0，期间流加甘油。甘油消耗完毕，菌密度达到200以上，DO急剧变化时，开始补加甲醇诱导表达，通过甲醇量控制DO在30％～40％，甲醇残余不超过1％，补充NH3H2O控制pH 5.6～5.8，诱导表达60h。

蛋白的纯化将发酵液在低温条件下离心，发酵上清超滤浓缩后，经C4-Sepharose疏水层析和CM-Sepharose层析纯化，即得rhNGF。

　2、结果　　

（1）酵母表达正交试验结果

　　根据实验结果，选择的较佳表达条件是：发酵温度28～30℃，甲醇诱导浓度为1.0％～0.8％，发酵pH 5.6～5.8，诱导表达60 h后收集发酵液上清。最高外泌表达活性可达104 U/mL。

（2） rhNGF的表达及活性测定结果

取甲醇诱导60h的发酵液，做SDS-PAGE和生物学活性检查。

　　电泳结果表明，工程菌表达分泌rhNGF量约为每升发酵液50 mg，约占外泌蛋白的50％，活性测定结果表明，分泌蛋白的活性约为每毫升培养液104U。

（3）蛋白纯化结果

　　电泳结果显示，该酵母表达系统表达的rhNGF，经疏水层析和阳离子交换层析纯化后，纯度可达到95％以上。2步纯化后的样品活性大于105U/mg。

（4）免疫印迹实验结果

　　将纯化后的rhNGF进行Western blot杂交分析，结果与抗NGF抗体呈阳性反应。

由于天然的NGF来源少，不能满足临床和科学研究的需要，因此，利用基因重组技术来获得大量高活性的人NGF蛋白已成为当务之急。Pichia pastoris 酵母表达系统具有高表达率、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等许多优点，同时作为真核生物，它能使外源基因正确翻译和翻译后加工，其蛋白糖基化的方式接近高等生物，临床应用更为安全。试验表明，运用Pichia pastoris 酵母表达系统可以表达NGF蛋白，而且具有较高的表达率，也为进一步的蛋白提纯提供了方便条件。