浅析昆虫杆状病毒表达载体系统的构建方法

杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)作为表达载体。昆虫杆状病毒表达载体是一种辅助性依赖，它仅有质粒载体不能表达外源基因，还需野生型杆状病毒辅助，形成整合有外源基因的重组型杆状病毒才能完成外源基因的表达的真核DNA表达载体。

近几年，以杆状病毒为载体的昆虫细胞表达系统以其表达效率高，插入外源基因的容量大，对哺乳动物安全而无致病性，能对表达的外源蛋白进行翻译后的提呈、加工、糖基化、转运等优点，受到分子生物学工作者的重视。构建重组昆虫杆状病毒，其关键在于构建转移载体质粒。美迪西科研人员建立了成熟的杆状病毒-昆虫细胞表达系统服务平台，提供包括重组杆状病毒制备、重组蛋白及其复合物的表达与纯化服务。

经过10余年的努力，人们已经构建了大量用于不同目的与不同需要的转移载体质粒。其基本要点是在基础质粒(如pUC质粒)上插人多角体蛋白基因及其两端侧翼，并在多角体蛋白基因启动子之下的编码区产生缺失，去除编码序列，然后在此缺失部位插人多接头，用于外源基因的克隆。用此载体与亲本病毒共转染昆虫细胞，利用载体中多角体蛋白基因的两端侧翼与亲本病毒DNA之间的同源性进行重组，从而获得含外源基因的重组病毒。从理论上讲有2种重组体形成方式，而这2种方式仅仅在于外源基因与杆状病毒基因组重组的方式不同，即或在昆虫细胞胞内或在昆虫细胞胞外进行。　　

1、在昆虫细胞胞内重组

较早时是用未加修饰的野生型病毒和转移载体进行重组，后来渐渐被线性化的病毒DNA代替，这种线性病毒DNA不能在胞内复制，因此不能启动感染，除非通过同源重组被拯救为环状的复制型。当它与转移载体共转染昆虫细胞时，如果不发生同源重组就无野生型病毒背景出现，故该系统同源重组率在理论上可达100％。

近年来对经典方法进行了许多改良，如直接克隆：已有一些昆虫杆状病毒载体包含了一个不依赖于克隆技术的重组体系。该体系避开了在大肠杆菌中克隆，加速了重组过程。最近，Gristsun建立了用PCR方法在体外直接形成外源基因－杆状病毒重组体的技术，其原理是通过设计的2条引物(上游引物的5’端、下游引物的3’端含有重组需要的杆状病毒表达部分序列)扩出外源基因，不需与转移载体连接，直接和线性化的野生型杆状病毒AcRP23―lacZ共转染昆虫细胞，然后通过蓝白斑表型筛选阳性重组体。

2、在昆虫细胞胞外重组

这类方法是，在昆虫细胞外将外源基因重组到病毒基因组，并且仅用重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞。在昆虫细胞外重组的技术至少已有3种：(1)在大肠杆菌胞内重组；(2)在酵母菌胞内重组；(3)不需要转移载体的体外重组。

有研究者创建了噬菌体P1的Cre―Lox重组系统，通过利用噬菌体P1编码Cre重组酶和它的底物LoxP获得高的重组效率，同时通过颜色选择快速、简单地进行重组体鉴定。但该法需要用空斑法在昆虫细胞中进行重组病毒的纯化，所以操作起来相当繁琐。如果能在大肠杆菌或酵母中扩增病毒DNA，并且让同源重组也可以在其中进行，那么重组病毒的筛选就会变得快速简便。

Patel等首先构建出含酵母的ARS(automously replicating sequence) 和 CEN(centromere)序列的重组病毒，并以此作为亲本毒株进行携带外源基因的重组病毒的构建。沿着Patel等人的策略，Luckow等人利用细菌Tn7转座子的作用，将外源基因插入在大肠杆菌中扩增的杆状病毒基因组中的特异性位点attTn7上，构建了能在细菌中扩增和重组的杆状病毒载体表达系统。另外，利用昆虫杆状病毒co-Ac，在该病毒基因组内设立供克隆用的酶切位点，可直接插入外源基因，实现不需要转移载体的体外重组。

3、杆状病毒表达系统的应用

目前，已经有多种基因在重组杆状病毒中进行了表达，包括有病毒基因、细菌基因、植物基因、无脊椎动物和脊椎动物基因，以及人类的基因等。这些基因的表达为研究它们的功能、应用、对疾病的预防和治疗等方面发挥了很大的作用。

（1）重组杆状病毒用于基因治疗

研究发现，杆状病毒虽然是昆虫专性病毒，但它能进入哺乳动物细胞而不能复制。在哺乳动物病毒启动子(如CMV立即早期启动子)的控制下，外源基因能在哺乳动物细胞多种细胞中表达，且对细胞无毒性。

在2003年，就有研究者提出了用杆状病毒作为基因治疗载体来治疗人类前列腺癌症的设想。在2006年有研究者采用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒Ac-CMV-Sox9，(Sox9是公认的能够延缓和逆转椎间盘退变的治疗基因)，证明Sox9基因(Ac-CMV-Sox9)能在离体培养的兔髓核细胞中有效表达，并能够促进退变的兔髓核组织细胞中Ⅱ型胶原含量增加而延缓和逆转椎间盘退变。

由于杆状病毒的启动子在哺乳动物细胞内是沉默的，因而它不能在哺乳动物细胞中复制和表达；同时杆状病毒的DNA游离于细胞内且不与宿主细胞内的基因物质以及机体中的潜在缺陷病毒进行整合，因而没有发生插入突变的风险；杆状病毒也不引起机体的免疫排斥反应；由此可见，BEVS可以作为一个极具开发和应用前景的基因治疗载体。

（2）以杆状病毒为载体的基因工程疫苗研究

杆状病毒作为基因工程疫苗研究的载体，既可以用来表达亚单位疫苗抗原，也可以直接用作DNA疫苗注射到体内，产生免疫效果。重组杆状病毒表达伪狂犬病毒糖蛋白、流感病毒血凝素、兔病毒性出血症病毒VP60蛋白等的DNA疫苗也获得了较好的免疫效果，表明重组杆状病毒DNA疫苗是一种具有良好发展前景的疫苗载体。