血浆制剂病毒灭活和去除方法及需要注意的问题

血液制品是临床上广泛使用的一类重要的生物制品，是以健康人血浆为原料，采用分离、纯化技术或生物工程技术制备的有生物活性的制品，包括人血白蛋白、静脉注射用人免疫球蛋白、人凝血因子、人凝血酶原复合物等。血液制品病毒的灭活与去除包含在一些生物公司提供的蛋白纯化服务中。选择化学或物理法对血液制品进行灭活，选择蛋白纯化或纳米膜过滤进行血液病毒去除对血液制品的安全性具有重要意义。

1、血液制品病毒的灭活与去除方法

（1）血液制品病毒的去除

血液制品病毒的去除可以采用纳米膜过滤和沉淀分离法。沉淀分离法是比较传统的蛋白分离纯化方法，具有成本低、操作简单、回收率高、设备要求低等优点。上海生物公司美迪西提供蛋白纯化服务，其可以根据客户的需求，提供从蛋白表达质粒的构建、蛋白表达条件摸索和蛋白纯化等一整套服务。

• 纳米膜过滤法能够有效去除非包膜病毒以及其他难以灭活的致病病原体，提高了目标蛋白产品的安全性，并且蛋白生物活性回收。

• 蛋白产品的制备过程中常包含有沉淀步骤，同时也有病毒去除的作用。

• 在冷乙醇沉淀过程中，各种病毒可能被分离至废弃组分中，蛋白纯化的同时进行部分病毒的移除；

• 深度过滤是一种重要的蛋白纯化手段，滤材会对部分病毒产生吸附，从而去除病毒；

• 层析技术是目前迅速发展的一种蛋白纯化方法，在纯化过程中蛋白产品被吸附在层析，而病毒存在于流动相中，在蛋白纯化的同时进行病毒的去除。率能够达到90%～95%。

（2）有机溶剂/表面活性剂（S/D）法

基本原理是有机溶剂和非离子表面活性剂的混合物能够破坏脂包膜病毒的类脂膜，从而使类脂从病毒表面脱落，使病毒失去黏附和感染细胞的能力。S/D法主要用于凝血因子制品、蛋白酶抑制剂、人免疫球蛋白等血液制品的脂包膜病毒的灭活。

（3）低pH孵放法

灭活机理是在pH4，温度30～37℃条件下保温超过20h，某些病毒成分产生变质，从而影响病毒的复制，最终使病毒失去传染性。低pH孵放在20世纪80年代初用于注射用人免疫球蛋白的制备过程中防止免疫球蛋白的聚合，随后发现其对大部分的脂包膜病毒有灭活作用，后被用于血液制品的病毒灭活。

（4）辛酸处理法

在低pH条件下，辛酸的非离子形式具有亲脂性，能够进入病毒脂包膜从而破坏脂质双分子层和相关蛋白质的完整性，使脂包膜病毒失去传染性，达到脂包膜病毒的灭活作用。由于辛酸法需要在低pH（通常pH＜6）条件下发挥作用，要求蛋白质产品在低pH条件下能够保持其稳定性，因此目前主要用于免疫球蛋白M和免疫球蛋白G的病毒灭活。

（5）光化学法

亚甲蓝（MB）/可见光处理法、补骨脂素/UVA处理法、核黄素/UV处理法等是目前常用的光化学方法，主要用于全血浆以及血小板制品的病毒灭活。

（6）巴氏消毒法

巴氏消毒法是在60℃条件下对蛋白质溶液进行连续加热至少10h，使病毒蛋白变性，从而抑制病毒遗传物质的复制，最终使病毒失去传染性。作为一种传统成熟的病毒灭活方法，巴氏消毒法可以用于白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白、蛋白酶抑制剂等血液制品的脂包膜和非包膜病毒的灭活。

（7）干热处理法

制剂冻干后加热处理，使病毒复制所需要的分子和结构改变，从而抑制其复制过程。干热法作为最终病毒灭活的关键步骤，能够保证凝血因子产品的病毒安全性。由于对病毒灭活能力的限制，此方法常用于凝血因子制品的辅助病毒灭活方法。

2、血浆制剂病毒灭活及去除需要注意的问题

（1）血型问题

目前国内申报的灭活血浆制剂有血型特异性和通用型（通用于ABO型）两种。如为血型特异性血浆，应强调必须采用单一血型的血浆混合制备，并在终产品中检测抗A抗B血凝素；如为通用型血浆，则必须制定终产品中抗A抗B血凝素的效价标准，并提供标准的制定依据（即表明该标准可保证临床安全性的依据），应同时考虑IgM和IgG两种抗体，一般前者采用直接法测定，后者采用间接法测定。

（2）凝血因子活性

血液类制品的主要临床价值在于其含有各种凝血因子，可用于多种原因引起的凝血因子缺乏症，所以凝血因子含量是本品的非常重要的质控指标。根据各种凝血因子的功能并参考国外同类产品的标准，建议在研制初期建立较全面的凝血因子检测项目，包括因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、ⅩⅢ等，并制定相应的标准。美国同类产品和新鲜冰冻血浆均含有不少于0.7U/ml的各种凝血因子，欧洲药典中将不稳定凝血因子的含量标准定为大于0.5U/ml。建议研制单位参考上述标准制定自身的标准，如自定标准较低，应评价凝血因子活性降低后对血浆凝血活性产生的影响及提供相应的研究资料，以便为各种凝血因子含量标准的制定提供依据。

（3）抗凝活性

血浆中的凝血活性和抗凝活性需保持平衡，如该平衡被打破，则有出血或血栓的危险，所以除保证制品中有足够量的各种凝血因子活性外，尚应考虑保持一定的抗凝活性。根据专家意见，建议在质量标准中设定AT-Ⅲ、蛋白C等检测项目。

（4）适应症定位问题

引入S/D病毒灭活技术为血浆的临床使用展开了空间，但是为了合理使用S/D血浆，应对其适应症重新定位并严格加以限制。参照国外批准的同类产品的适应症并结合我国的实际情况，建议将本品适应症限定为各种原因引起的凝血因子缺乏和用于严重烧创伤、大手术所致的急性失血性休克病人胶体与凝血因子的补充。

其中凝血因子缺乏适应症可参照VIPLAS/SD产品的使用说明书制定，包括遗传性单凝血因子缺乏、获得性多凝血因子缺乏、华法令抗凝过度及血栓性血小板减少性紫癜等。对于大部分凝血因子缺乏的患者，提供单一凝血因子或凝血因子浓制剂可能更为合理。