支原体清除实例
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下一篇 2016-04-18 19:07:01/ 个人分类:实验方法
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在细胞拍养过程中很容易发生支原体污染,许多人这时候采取一扔了之的办法。但是如果重要的细胞发生了支原体污染,这时候怎么办呢?下面给大家介绍一个清除支原体污染的实例,以供参考。
材料:
细胞系:SH-SY5Y
检测试剂盒:Myco-P-20 (炎熙生物)
支原体清除剂:Myco-E-1 (炎熙生物)
方法与结果:
1,
将已检测出有支原体污染的SH-SY5Y细胞以正常传代密度铺到6孔板中,一个孔加清除剂,作为测试孔,另一孔不加清除剂,作为阴性对照孔。两孔之间间隔一个孔,以免互相污染。
2,
在清除支原体的过程中细胞以常规方法传代培养。在加清除剂后第4、8、9、11天各取1毫升培养上清。每份上清与细胞已共培养48小时,除第9天的上清只共培养了24小时。
3,
将这些培养上清在16000g离心5分钟,小心去除离心上清,将沉淀用无菌PBS洗三次,每次以16000g离心5分钟。最后获得的沉淀用100微升PBS重悬,在100℃水浴中孵育5分钟,然后用于PCR反应。
4,
按照支原体检测试剂盒Myco-P-20的说明书进行PCR检测操作,结果如下:
4.1,与对照样品共同反应,用这种方式可以判断是否出现了假阴性结果。在加清除剂后第4天的样品中仍可见到支原体阳性条带(~440bp), 在第8、9、11天的样品中,已看不到支原体阳性条带。
4.2,不加对照样品,检测样品单独反应,用这种方式可以提高测试灵敏度。可见在第8天和第9天的样品中,支原体阳性条带仍然出现,但是弱于第4天的样品。在第11天的样品中,有明显的200bp以下的非特异的条带,且亮度高于阳性条带,所以判断此时的PCR产物是非特异反应的产物,样品中已没有支原体DNA。
注释:
由于PCR是一种非常灵敏的检测方法,所以很容易出现假阳性条带。假阳性条带的出现主要是由于环境污染导致,其中的DNA模板可能是操作中带入,也可能是所使用的耗材和器具等带入。耗材和器具灭菌并不能消除假阳性,因为支原体死亡后残留的DNA仍可以作为模板进行PCR反应,从而导致假阳性。所以谨慎操作和清洁的环境非常重要。
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