可定制的高通量PROTAC体外泛素化测定试剂盒

上一篇 / 下一篇 2023-07-21 16:17:05/ 个人分类：生化试剂

泛素与泛素偶联机泛素是一种小多肽，可以通过其C末端与赖氨酸的胺基结合靶蛋白上的残基。这种结合被称为单泛素化。附加泛素部分可以利用存在的七个赖氨酸残基中的任何一个与该初始泛素缀合在泛素中。这些泛素链的形成被称为多泛素化。最井这种多泛素化的特征是通过泛素（K48）48位的赖氨酸形成链-链接的链）。单泛素化已被证明可以改变靶蛋白。多泛素化最普遍的结果是蛋白酶体介导的靶蛋白的降解。

泛素与靶蛋白的结合需要三种不同连接酶的协同功能，E1（泛素激活酶）、E2（泛素偶联酶）和E3（泛素连接酶）产生在泛素的C末端和e-赖氨酸的氨基靶蛋白上的残基。泛素E3连接酶作为支架蛋白，为泛素结合酶（E2）和靶底物。通常，E3连接酶介导转移泛素从E2硫酯中间体到与底物蛋白的酰胺连接（Hershko和Ciechanover，1998）。除了底物的泛素化，E3连接酶还可以“自动”泛素化”本身。

PROTACs（针对嵌合分子的蛋白质水解）人为劫持UPS的成分降解靶蛋白。PROTAC药物是含有两个通过连接体连接的功能配体；一个配体与靶蛋白结合，另一个配体结合至E3连接酶。理论上，将这两个实体接近会导致多泛素化和靶蛋白的蛋白酶体降解。然而，考虑到这种情况的复杂性PROTAC发现策略面临着一些挑战和陷阱。电流在评估PROTAC时，分析解决了许多这些挑战，并作为一种有效报告的工具通过监测PROTAC介导的泛素化来实现真正的PROTAC效率。

体外泛素化试剂盒以建立一种高通量方法通过监测蛋白质获得泛素化的内在能力来准确预测PROTAC的效率。我们提供了三种E3泛素连接酶Cereblon、VHL和HDM2的试剂盒，以监测PROTAC介导的选择目标的泛素化。在测定的核心，微量滴定板条，预先涂有专有的TUBE试剂（测定板）用于捕获PROTAC依赖性反应。对于测定，首先将PROTAC加入测定板中，然后加入E3连接酶和靶蛋白，使三元复合物形成。作为一个序列步骤，将含有wt泛素和ATP的E1-E2酶混合物加入到孔中以启动PROTAC介导的泛素化。在反应过程中，E1-E2-E3产生的多泛素链机器被识别并捕获在井中。在反应和随后的洗涤之后步骤，分离的多泛素化产物与针对感兴趣的蛋白质的抗体（不是包括）和与HRP缀合的第二抗体（包括），允许通过化学发光。因此，在这种情况下，由捕获的多泛素化产物产生的信号“夹心”ELISA样测定是PROTAC活性的定量测定。此外检测策略不需要额外的非天然标记或泛素标记可能导致实验性伪影。