AT 655 琥珀酰亚胺酯/AT 655 NHS Ester

琥珀酰亚胺酯（SE，也称为 NHS 酯）与伯胺反应，例如蛋白质中的赖氨酸残基。 琥珀酰亚胺酯标记通常用于结合蛋白质和抗体。 该反应需要目标蛋白上的胺基去质子化并与 SE 反应的碱性 pH，通常在 pH 8.3 的碳酸氢盐缓冲液中进行。 琥珀酰亚胺酯染料具有在水存在下随时间水解的缺点。 多磺化染料，例如 Alexa Fluor® 染料、DyLight® 染料和 IRDye® 尤其具有吸湿性，会加剧水解问题。

艾美捷AT 655 琥珀酰亚胺酯：

Cat#：B-CHM502/B-CHM503/B-CHM504/B-CHM505

规格：1 mg

储存：在-20°C下储存，避光

形态：结晶固体

光谱特性：见上文

储存条件：储存温度为-20°C，避光。

稳定性：在适当的储存条件下稳定至少12个月。

用AT NHS标记蛋白质的建议方案：

AT NHS酯很容易与蛋白质的氨基反应。NHS酯结合的合适pH范围是pH

8.0-9.0。在这个pH范围内，蛋白质的氨基，特别是赖氨酸的氨基，被充分去质子化以进行快速偶联。

AT 655 琥珀酰亚胺酯所需材料：

1、溶液A:PBS缓冲液（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4）：将8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4-2H2O和0.24 g KH2PO4溶解在1L蒸馏水中。

2、溶液B:0.2 M碳酸氢钠溶液，用2 M氢氧化钠将pH调节至9.0。

3、溶液C：将20份溶液A和1份溶液B混合，得到pH为8.3的标记缓冲液。将该溶液储存在密封瓶中，以保持长期稳定性。

4、溶液D：将1.0 mg NHS酯溶解在50-200 ul无水、不含胺的二甲基亚砜（DMSO）或乙腈中。

蛋白质结合物的储存

通常，缀合物的储存条件应与未修饰蛋白质的储存条件相同。当溶液在4℃下储存时，建议添加叠氮化钠作为防腐剂（最终浓度为2mM）。在将缀合物添加到活细胞标本中的应用中，可能需要在使用前去除防腐剂以避免抑制作用。缀合物应在4C下稳定数月。对于长期储存，溶液可以分成等分试样，并在-20°C下冷冻。避免重复冷冻和解冻。染料偶联物应尽可能存放在避光的地方。

确定平均标记度（DOL）

平均标记度（DOL）表示染料分子与蛋白质分子的比例，可以通过吸收光谱法使用朗伯-比尔定律来确定：吸光度（A）=消光系数（e）×摩尔浓度x路径长度（d）。在石英（紫外透明）比色皿中凝胶过滤后，只需测量共轭溶液的紫外-可见光谱。如果溶液浓度过高，无法准确测量吸光度，则可能需要稀释溶液。在染料的最大吸收波长（abs）和280nm（A280）（蛋白质的最大吸收率）下测量吸光度（Ama）。染料浓度的计算公式为：c（染料）=Ama/Emx x d，其中Ema是染料在最大吸收波长下的消光系数。类似地，基于280 nm处的吸光度，使用公式确定蛋白质浓度：c（蛋白质）=Apot/Eprot x d，其中Eprot是280 nm处蛋白质的消光系数。由于所有染料在280nm处都具有一定的吸光度，因此必须根据染料的贡献来校正在A280处测量的吸光度。蛋白质浓度可计算为：Aprot=A28o-Amax×CF²8o，然后c（蛋白质）=Anot/Eprotxd。标记程度，代表与蛋白质分子结合的染料分子的平均数量，可以基于

关于上述关系。

仅供研究使用，不用于人类或临床诊断

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