AFLP技术的基本原理和实验流程

上一篇 / 下一篇 2009-07-22 20:23:53

1 cDNA-AFLP技术的基本原理和实验流程

AFLP技术是一项新的分子标记技术，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。

　cDNA-AFLP技术结合了RT-PCR和AFLP技术，其基本原理：以纯化的mRNA为模板，反转录合成cDNA。用识别序列分别为6-bp和4-bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶切片段与人工接头连接后，利用与接头序列互补的引物进行预扩增和选择性扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示．

　　cDNA-AFLP的实验流程大致可分为四步（图1）：（1）模板的制备和cDNA的合成；（2）双链cDNA片段的酶切和人工接头的连接；（3）酶切片段的预扩增和选择性扩增；（4）凝胶电泳分析[4]。预扩增过程为选择性扩增提供了大量充足的模板。而且cDNA-AFLP所用的原始材料量极少，每份样品约100~200mg，因而可对小组织样品进行精确筛选[3]。用AFLP分析基因组DNA时，引物的3′端需用3个选择性碱基。cDNA相相对简单，引物3′末端用2个选择性碱基，约256个引物组合即可满足实验的需要。cDNA-AFLP扩增的片段大小在100bp~1000bp之间，平均每对引物约扩增50条谱带。因此，利用一对合适的内切酶组合和256对引物即可得到大约13000条带。

2 cDNA-AFLP的技术特点

2.1 选择合适的内切酶组合
　　标准的cDNA-AFLP体系中，采用识别序列分别为6-bp和4-bp的双酶切组合。在基因组AFLP分析中，限制性内切酶的选择取决于基因组的复杂度和DNA的甲基化水平。分析cDNA时，内切酶的选择主要取决于切割的频率。理想的酶切组合是识别位点为6-bp的酶在每个cDNA样品中有一个酶切位点，而在其一边或两边有一个4-bp的酶切位点，酶切片段的大小在100bp~1000bp之间。因此，内切酶的选择应最大限度覆盖mRNA池，且所选的酶切组合可同时进行酶切和接头的连接，减少酶切片段之间的互相连接造成的假象。因此，在选择内切酶时，充分利用已发表的cDNA序列进行分析，筛选最佳的内切酶是一条行之有效的途径。还可根据cDNA3′端和5′端非翻译区富含A、T的特性，选择识别序列的碱基组成集中在有义的cDNA区段的内切酶，实现有目的的选择扩增。据推测，植物基因组中大约可编码16000至33000个基因。若选择合适的酶切组合进行分析，几乎所有的表达基因包括信息量极低的基因均可用cDNA-AFLP检测。Bachem 等人利用AseI和TaqI酶切马铃薯块茎形成过程的cDNA，约45%的片段含AseI位点，87%的片段含TaqI位点，结合256个引物组合至少可分析一半的表达基因。Hartings等人通过筛选，用BstYI和MseI分析玉米不同mRNA之间的大量差异表达转录子。BstYI引物的选择性碱基改用简并引物，仅用64对引物组合，即可对75%的mRNA进行分析，128对引物组合即覆盖了95%以上的mRNA，实现了用最少的引物组合最大限度分析差异表达的mRNA。6-bp识别序列的内切酶只能分析少数物种的cDNA。Habu等人[10]对标准cDNA-AFLP体系进行了修改，仅用一个识别4-bp的内切酶，大大提高了可检测的cDNA信息量。

2.2 重复性好，假阳性低，可检测低丰度表达的mRNA
以PCR扩增为基础的DD-PCR和cDNA-AFLP是目前较为常用的分析差异表达基因的方法。DD-PCR使用随机引物，退火温度低，引物可在多个位点结合，扩增产物不仅依赖于cDNA的初始浓度，还与引物和模板的结合质量有关。因此，DD-PCR假阳性高，重复性差，难以对基因表达进行全面的分析[5,11]。cDNA-AFLP则利用特异引物扩增，提高了PCR反应的严谨性，克服了DD-PCR的不足。为了验证cDNA-AFLP的可靠性，Bachem等选取了一个序列已知的对照基因—Patatin B2进行了分析。在引物选择性碱基为AseI-AA和TaqI-AC时，预测会得到一个片段大小为570bp的TDF（transcripts-derived fragment）。结果表明，获得的TDF大小与预期的一致。将获得的TDF克隆、测序后，99%的碱基组成与已知序列相同。同时以另一已知基因—AGPase进行了比较分析，获得了一致的结果。Habu等[10]研究牵牛花的红、白花色差异表达基因时，比较了DD-PCR和cDNA-AFLP的扩增结果。在DD-PCR分析中，128对引物组合扩增得到6500条带，其中有差异的为171条。在随机选取的36条差异带中，仅15条可重复再现，其中只有两条带真实反应了mRNA之间的差异。而用cDNA-AFLP分析时，96对引物即得到了5000条带，其中差异带为14条。随机选取其中5条差异带进行验证，重复性可达100%。此外，DD-PCR利用polyT和随机引物，常常导致3′端非编码区序列的大量扩增，包含的差异表达基因的信息量相对减少[12]。研究证实[3,13]，通过cDNA-AFLP获得的TDF则集中在基因的蛋白编码区或其附近区域，可最大限度获取编码区的信息。

2.3 准确反映基因间表达量的差别
在RNA差异显示中，PCR反应条件不严谨，错配率较高，扩增条带的强度与基因的表达量无直接相关性。而cDNA-AFLP技术的最大优点就是转录产物高度表达时，扩增条带的强度能够准确反映基因间表达量的差别。Bachem等人充分利用cDNA-AFLP技术的这一优点，对马铃薯块茎形成过程的基因表达特性进行了研究，并获得了多个块茎形成过程中特异表达的TDF。1996年，Bachem等人首次用cDNA-AFLP获得了两个马铃薯块茎形成过程中特异表达的TDF531 和TDF536。序列分析表明，二者与编码块茎中脂肪氧化酶的两个LOX高度同源。TDF531在块茎形成0~2天时低水平表达，然后平稳增至第10天达到高峰。TDF536则在第6~10天表达。同时通过不同组织分析表明，二者在匍匐茎、叶和叶柄中不表达，茎和根中低水平表达，具高度的块茎形成特异性。Huang等[14]在研究采后72小时内木薯块茎采后生理变质的分子机理时，根据表达强度对获得的TDF进行分析表明，有诱导表达、减弱表达、瞬时表达和特异表达四种不同的表达模式参与了这一过程。

2.4 全面获取转录组的表达信息
cDNA-AFLP不需要预先知道任何序列信息，且实验操作简便，可在任何实验室进行。与SGAE和微阵列相比，该技术更适合对生物体转录组进行全面分析。随着拟南芥和水稻等模式植物基因组测序的逐渐完成，表达基因的研究逐渐从某一发育阶段的某一基因转向全面的基因表达分析上。Donson等以拟南芥的各种组织和不同处理的植株为实验材料，通过对获得的cDNA-AFLP片段进行系统测序，建立了高容量的转录组表达数据库，可覆盖三分之二的拟南芥转录组，大大方便了差异表达基因的筛选。而对于三分之一未测序的转录组，可根据cDNA-AFLP片段在凝胶上的迁移率、内切酶酶切位点和选择性碱基及条带强度等信息通过数据库进行预测，准确率可达90%。

3.AFLP技术的应用：

AFLP具有可靠性好，重复性强，可信度高等优点，近年来广泛应用于遗传育种研究，在动物遗传育种、动物基因组研究中有着广泛的应用前景。

1、构建遗传连锁图谱

2、利用AFLP快速鉴别与目的基因紧密连锁的分子标记

3、AFLP辅助的轮回选择育种

4、利用AFLP技术研究基因表达与调控

5、分类和进化研究

6、甲基化研究

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