细胞培养及常见的几个问题

　　谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗? L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

　　GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定? GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 什么培养基中可以省去加酚红?酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。

　　研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，(特别是雌激素)。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。如何用台盼兰计数活细胞?用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/毫升，在0.1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色细胞是死细胞。

　　培养基中丙酮酸钠的作用是什么?丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。 室温下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少?缓冲液PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同PH值。 50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同PH值 4°C 25°C 37°C 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.4 8.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 如何从T25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗?我们推荐使用脱落细胞的方法，此技术破坏性最小，生活力最高。通过使用巴斯德吸液管，让细胞上培养基流动。

　　作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。 胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞： 1. 去除培养基。 2. 用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞，去除PBS。 3. 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆盖细胞表面)。 4. 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。 5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性。) 6. 离心(1100rpm)沉淀细胞。去除培养基。 7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。 39.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少? 为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代?随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗?通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候计数时，都应该检查细胞活力。

　　如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。 贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，在放置几天后颜色变紫? 这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的 pH值(确定松开瓶口以保证气体交换)。 细胞培养基偶然被冻，可否继续使用?如果细胞培养基偶然被冻，您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗?当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。 培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗?一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。

　　因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗?大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。为什么要在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液? 胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。保存血清最好的方法? 我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃时，请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。如何解冻血清才不会使产品质量受损? 将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理? 血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。

　　为什么要热灭活血清? 加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞、平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 有必要做热灭活吗? 实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

　　若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量! 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀? 有些胎牛血清产品没有预老化，储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。 如何避免沉淀物的产生? 我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作: (1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，非常容易产生沉淀物。 (2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。 (3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。 (4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。 (5)若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。