水稻WRKY转录调控因子基因功能研究进展

　　摘　要：WRKY 转录调控因子的生物学功能涉及植物生长发育、物质代谢、抗病耐逆、氧化衰老等诸多方面。水稻全基因组测序完成后，水稻WRKY转录调控因子基因的功能研究随之逐渐开展，目前已经发现它在植物抗病、耐逆、衰老、糖代谢以及形态建成方面发挥重要作用。随着研究的深入，水稻WRKY基因的编号未能统一，很容易让人混淆，有必要进行校正。结合作者实验室的一些研究结果，对水稻WRKY基因家族的研究现状进行了综述，以期为进一步深入开展WRKY 基因家族的研究提供帮助。

　　中国水稻科学 (Chinese Journal of Rice Science)，2009，23：447-455。

　　前言

　　水稻全基因组测序工作的完成使水稻成为粮食作物中基因背景最为清晰的物种[1]，也为其他单子叶植物基因组测序工作提供了很好的参考。同其他生物一样，水稻基因组中也包括编码转录调控因子的基因，其中一些转录调控因子家族拥有上百个成员基因，比如MYB家族，WRKY家族，AP2/EREBP家族，bHLH家族，bZIP家族，C2H2家族，NAC家族等[2, 3]，它们在水稻的生长发育和耐逆抗病过程中都发挥重要的生物学功能。

　　真核生物中的转录调控因子又称反式作用因子，是一类通过与其靶基因启动子区域的顺式作用元件特异性结合，从而影响靶基因转录水平显著变化的DNA结合蛋白。这种结合的特异性反映在转录调控蛋白特殊的空间结构和顺式作用元件基本对应的核酸序列上。WRKY转录调控因子家族中大部分成员具有典型的WRKYGQK结构域，部分为WRKYGKK[4]，而在水稻中又发现了新的WRKY结构域WRKYGEK[5]。WRKY转录调控因子蛋白结合的DNA序列是W盒(T)TGACC(A/T)，一般认为核心序列是TGAC的启动子序列就具备一定的W盒功能[6]。

　　到目前为止，通过生物信息学的方法已经在水稻的两个栽培种粳稻日本晴(japonica)和籼稻93-11(indica)中分别预测到103个和102个WRKY基因[7, 8]。自2000年第一个水稻WRKY基因OsWRKY4被克隆后[9]，已有数篇报道揭示水稻WRKY基因的功能广泛地涉及了由病毒[10]、细菌、真菌[11~13]等引起的病害反应及SA和JA相关的信号通路[11]。我们率先对水稻WRKY基因进行非生物逆境胁迫后的表达谱分析结果表明一些WRKY基因很可能涉及了水稻的耐逆反应[5]。进一步功能分析发现外源性的高表达OsWRKY45会增强转基因拟南芥对干旱胁迫的耐性[14]，内源性的过表达OsWRKY11可以增强水稻对高温和干旱胁迫的耐性[15]，它们均从遗传学的角度证实了水稻WRKY转录因子参与植物耐逆性的推测。其次还发现外源性的高表达OsWRKY23会促进转基因拟南芥叶片的衰老[16]，而一些报道也推测OsWRKY17[17]、OsWRKY4和OsWRKY82 [18]很可能在水稻的衰老过程中发挥一定的作用。此外还报道了外源性的高表达OsWRKY72可以影响转基因拟南芥植株的形态建成[19]，内源性的过表达OsWRKY31会影响水稻根的形态建成[20]。由此可见水稻WRKY基因的功能具有重要性和多样性。

　　结合本实验室的相关结果，我们对水稻WRKY转录调控因子家族成员的分类情况和已报道水稻WRKY转录调控因子基因的功能做一综述，以期对未来的研究有所帮助。

　　1. 水稻WRKY转录调控因子的系统分组和编号

　　2004年首先由Shen实验室(77个)[21, 22]和我们实验室(97个)[5]报道了水稻WRKY转录调控因子成员的基因注释及各成员分组情况。2005年Guo等[8]和Zhang等[23]各自发表了关于水稻WRKY转录调控因子家族成员的分组情况。而最新发表在《植物学报》上的分组情况则是由Shen实验室的进一步完善[24]。以上四个小组的分组基本上利用了Eulgem等的分组原则：第一类型的成员蛋白序列含有两个典型的WRKY结构域和Cys2-His2锌指型结构，第二类型的成员拥有一个典型的WRKY结构域和Cys2-His2锌指型结构，第三类型则以其成员含有一个典型的WRKY结构域和Cys2-His/Cys锌指型结构为基本特征[4]。由于在分类过程中对WRKY成员命名的差异，除了本实验室和Shen实验室保持一致以外，其它两组的命名序号存在较大差异。比如由Xie等和我们命名的OsWRKY72，在Wu等的文章中被命名为OsWRKY92，在Zhang and Wang文章的中被命名为OsWRKY78。此类问题造成了行文和说明的不便，也困扰着国内外同行[7]。统计目前已发表文章的使用情况，大部分根据Xie等和我们的编号，两篇采用Wu等的编号，而Zhang 等的编号基本未被采纳。根据优先原则，我们建议使用本实验室和Shen实验室一致的编号，并调整OsWRKY55和OsWRKY100的命名(同OsWRKY31与OsWRKY89调换)。我们主要采用随机编号的方式依次将新发现的基因顺次编号[5, 21, 22, 24]，这种编号方式在不破坏原有编号次序的情况下有利于新鉴定基因的命名和排序。为了便于查阅，我们将三种编号方式统筹成表(表1)。

　　比较两种主要的编号方式和基因注释可以发现都存在一些问题。虽然Wu等对水稻WRKY的编号总体上采用了顺染色体的位置命名[8]，但其中二十多个成员的顺序并不符合该规则，如从OsWRKY96(Os12g02470)到OsWRKY100(Os12g02400)都没有绝对顺染色体位置命名(表1)。其次，Os03g21710、Os11g02520、Os12g02400、Os12g02440四个WRKY蛋白由Wu等命名为OsWRKY32、OsWRKY89、OsWRKY100、OsWRKY98，而Xie等则命名为OsWRKY44、OsWRKY100、OsWRKY81、OsWRKY56，但是两组WRKY蛋白的序列不一致 [8, 22]。另外，值得注意的是不能排除在水稻中有新的WRKY基因被鉴定，这些新的成员将无法采用顺染色体的位置命名的方式，如Os04g04300和Os08g09840[7]，我们将其补充命名为OsWRKY101和OsWRKY102(表1)。

　　2. 水稻WRKY转录调控因子的生物学功能初步分析

　　表达谱分析有助于对基因功能做初步的推测，主要采用Northern 杂交、RT-PCR、Microarray等分子生物学方法。模式植物拟南芥WRKY转录调控因子的功能研究一开始就进行了表达谱的分析，成功地预测了在植物耐逆和抗病反应中发挥重要生物学功能的成员基因。更进一步的遗传学研究则证实这些WRKY转录调控因子在调控植物免疫反应方面具有普遍性 [25]。近年来在水稻中也证实了一些成员参与植物免疫反应，主要有OsWRKY12[26]、OsWRKY13[27]、OsWRKY45[13, 14]、OsWRKY53[12]和OsWRKY71[28, 29]。除参与生物逆境的应答反应外，一些水稻WRKY转录调控因子还受盐害、干旱、低温、高温[5, 7, 14, 15]和辐射[30]等非生物逆境的诱导。此外，还有研究表明水稻WRKY基因家族成员在调控植物的衰老过程和形态建成过程中具有重要作用。

　　2.1参与抗病 植物中大多数WRKY转录调控因子参与抗病反应的信号传递。由于对水稻WRKY基因家族的研究起步较晚，目前大多数结果只停留在利用病原菌处理后的表达谱分析上。用稻瘟菌(Magnaporthe grisea)和白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)处理后的基因分析显示，超过1/3的WRKY基因表达水平发生显著变化[11]，其中较为详尽的研究主要集中在OsWRKY12、OsWRKY71、OsWRKY45和OsWRKY13在病害侵染过程中的分析。OsWRKY12在抗病过程中的作用首先是利用其在白叶枯细菌、水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理后受诱导的表达谱推断的，转基因水稻的功能研究发现过表达OsWRKY12基因后水稻内源的抗病基因OsNPR1、OsPR1b、ZB8和POX22.3的表达水平均显著上调[26]。OsWRKY71在抗病过程中的作用首先是利用SA和MeJA处理后的表达谱分析发现的，它的表达量在处理后0.5小时就有明显增强，过表达OsWRKY71的转基因水稻对细菌性白叶枯病的抗性得到了增强，而且抗病相关基因OsNH1和OsPR1的表达量也在转基因水稻中显著增强[28]。与此同时，另一研究小组还发现OsWRKY71受真菌蛋白Chitin oligosaccharide 和Fugal cerebroside的诱导，它的表达量也在处理后0.5小时就明显增加，基因芯片分析发现过表达OsWRKY71的转基因水稻编码几丁质酶(Chitinase)的6个基因和PR5基因的表达量显著增强[29, 31, 32, 33]，这些都为过表达OsWRKY71的转基因水稻增强对细菌性白叶枯病抗性的分子机理提供了证据;相类似的是OsWRKY53基因，同OsWRKY71的表达谱相似，它也受上述两个真菌蛋白和稻瘟菌诱导[12, 31, 32]，且过表达转基因植株内PBZ1、PR14、Chitinase1、PR5 和 Chitinase2的表达量也显著增强，进而表现出了对真菌性稻瘟病的抗性[12]。和OsWRKY71不同的是OsWRKY45，OsWRKY71过表达水稻中NH1的表达量是显著增强的，OsWRKY45的水稻突变体和NH1的水稻突变体都不会影响对方的表达水平，而OsWRKY45的突变体和过表达水稻都不会显著影响抗病相关基因PR1a和PR1b的表达，但却能显著抑制和诱导GST和P450的表达，更为深入的结果还表明BTH诱导的OsWRKY45在水稻抵抗稻瘟病过程中发挥重要的作用[13, 34];另外，在细菌性白叶枯菌和真菌性稻瘟菌侵染水稻的过程中发现被诱导的OsWRKY13[35]可以调控部分水杨酸信号途径上游或者下游的基因[36]，过表达OsWRKY13的转基因水稻还表现出对细菌性白叶枯菌和真菌性稻瘟菌的明显抗性[27]，OsWRKY13表达受抑制的转基因水稻则对上述病害更加敏感，这些结果强有力地说明OsWRKY13可以通过调控作用激活水稻的抗病反应，更为细致的工作还找到了在此抗病反应信号途径中调控OsWRKY13的上游元件[37]。

　　另外很多实验室在对水稻进行抗病实验的同时也筛选到一些表达量受影响的WRKY基因。在亲和性稻瘟真菌侵染水稻的过程中， OsWRKY28、OsWRKY56、OsWRKY45、OsWRKY72、OsWRKY26 [38]和OsWRKY52基因显著上调5倍以上[39];在水稻矮缩病毒侵染水稻9天后，OsWRKY77、OsWRKY55、OsWRKY8基因显著上调2倍以上[10];在半寄生植物菟丝子(Striga hermonthica)与水稻相互作用的过程中，OsWRKY19、OsWRKY45、OsWRKY62、OsWRKY76、OsWRKY77等基因显著上调5倍以上[40]。

　　2.2参与耐逆 在很多植物中都发现WRKY转录调控因子参与逆境耐受的信号转导过程，如大麦(Hordeum vulgare)的HvWRKY38受冷害和干旱的诱导[41]，沙漠药用常绿灌木三齿拉瑞阿(Larrea tridentata)的LtWRKY21基因可以激活脱落酸信号转导途径并参与脱落酸介导的抗旱性的建立[42]。在筛选水稻受逆境诱导的WRKY转录调控因子的研究工作中，我们发现OsWRKY8、OsWRKY9、OsWRKY12、OsWRKY13、OsWRKY14、OsWRKY16、OsWRKY17、OsWRKY21、OsWRKY23、OsWRKY24、OsWRKY26、OsWRKY30和OsWRKY45在高盐、干旱、冷害、高温等四种逆境因子胁迫中不同程度地被诱导[5]。外源高表达转基因拟南芥遗传学分析证实OsWRKY45参与植物耐干旱和盐害的胁迫反应，这种转基因拟南芥耐旱性和耐盐性的改变是和ABA依赖性的多个耐逆基因相关的[14]。进一步得到的OsWRKY45内源过表达转基因水稻也表现出了较好的耐旱性(http://www.xtbg.ac.cn/Upload/Show_News.aspx?id=2794)，而新近的实验还发现OsWRKY11内源过表达转基因水稻也表现出了耐旱性[15]。此外，Wang等发现OsWRKY89的过表达增强了转基因水稻对紫外辐射的耐受能力，这种耐受能力是通过改善水稻叶表面的蜡质代谢和叶绿素分布而实现的[43]。

　　相关的表达谱分析结果也显示，在冷害处理下15个WRKY基因的表达量显著下降，而OsWRKY79基因的表达量显著上调;在干旱处理下19个WRKY基因的表达量显著上调;在盐害处理下25个WRKY基因的表达量显著上调，而OsWRKY74基因的表达量显著下降;另外在激素ABA的处理下10个WRKY基因的表达量显著上调，6个WRKY基因的表达量显著下降[7]。

　　2.3参与衰老 在拟南芥WRKY蛋白的研究中，直接报道与衰老相关的WRKY转录调控因子有AtWRKY6[44]、AtWRKY53[45]和AtWRKY70[46]。另外还有一些间接的结果暗示AtWRKY3、AtWRKY4、AtWRKY7和AtWRKY11可能参与衰老调控[44]。到目前为止还没有直接的证据证实水稻WRKY转录调控因子调控水稻的衰老进程，但是有一些证据暗示了这种相关性。在水稻旗叶衰老早期进展中被诱导表达的WRKY基因有OsWRKY4和OsWRKY82[18]，而水稻在缺铁情况下发生的衰老过程中OsWRKY17表达水平被上调[17]。此外，我们实验室发现OsWRKY23主要在水稻衰老叶片中表达，并促进高表达转基因拟南芥离体叶片在黑暗处理中的衰老进展[16]。

　　2.4参与糖代谢 最早在甜薯中克隆到的WRKY基因SPF1基因的功能涉及调控糖代谢信号途径[47]。大麦中的WRKY蛋白HvWRKY2(SUSIBA2)可以通过特异地结合到异构淀粉酶1(iso1: isoamylase1)基因启动子区域的SURE元件和W盒序列，在转录水平上调控iso1基因的表达[48]。受水杨酸诱导的HvWRKY38蛋白质通过特异地结合到a-淀粉酶(Amy32b)基因启动子区的W盒序列诱导a-淀粉酶基因的表达，并阻断赤霉素信号途径[49];而与HvWRKY38高度同源的OsWRKY71蛋白也可以通过与a-淀粉酶基因启动子区的W盒序列结合进而抑制赤霉素诱导的Amy32b基因的表达[21]。进一步研究发现水稻糊粉层细胞中OsWRKY24、OsWRKY51、OsWRKY71、OsWRKY72等基因受脱落酸诱导表达。通过瞬时表达体系证实OsWRKY24和OsWRKY45蛋白质能有效地抑制ABA信号转导途径，而OsWRKY72和OsWRKY77则激活ABA信号转导途径[22, 50]。更进一步的研究则显示脱落酸诱导的两个基因OsWRKY51和OsWRKY71在水稻种子的糊粉层细胞中能有效地抑制赤霉素信号转导途径[51]。另外还发现水稻悬浮细胞在糖饥饿条件下会诱导OsWRKY62、OsWRKY67、OsWRKY45等多个WRKY基因的表达量发生变化[52]。

　　2.5 参与形态建成 有关WRKY转录调控因子调控植物形态建成最经典的例证是AtWRKY44(TTG2)可以通过和其它相关基因的作用调控毛状体的发生与否、数目多少和分叉情况，暗示AtWRKY44对表皮毛状体的形态建成有贡献[53]。较为深入的研究还发现AtWRKY44还参与调控拟南芥根毛细胞的分化[54]，而RNAi 抑制AtWRKY75的表达后增强了拟南芥不定根和根毛的生长，这种调控作用独立于其参与磷代谢的功能[55]。在水稻形态建成过程中参与进来的WRKY转录调控因子研究目前只有两例。过表达OsWRKY31抑制了水稻不定根的形成，进而影响水稻根的形态建成[20]，同时还发现这种影响伴随着对生长素响应反应的干预。有关生长素响应生理反应的研究发现，生长素信号途径的紊乱会导致极性运输的正常进行，会表现出顶端优势丧失的表型出现[56]，而我们的异源高表达OsWRKY72转基因拟南芥就出现了这类表型[19]。另外我们还比较了内源性过表达OsWRKY31水稻和外源性高表达OsWRKY72拟南芥根的生长情况，发现转基因植株均出现不定根生长受抑制的典型表型(Fig 1)。我们认为，水稻的一些WRKY转录调控因子很可能通过影响生长素信号途径进而影响植物的形态建成，而此类研究的深入很可能会丰富生长素响应基因、WRKY转录调控因子和植物抗病基因构成的调控网络。

　　3. 水稻WRKY转录因子参与广泛的转录调控

　　在拟南芥、烟草和大麦等多个物种中已经有结果显示WRKY蛋白可以直接结合到一些靶基因启动子区的W盒上而对相关靶基因进行转录水平的调控。如拟南芥的WRKY蛋白可以直接结合在抗病相关基因PR1和NPR1的启动子区对其进行调控进而影响植物的免疫反应[25]，大麦的WRKY蛋白可以直接通过结合启动子区调控ISO1基因和Amy32b基因的表达水平，从而影响糖代谢途径[48, 57]。有关水稻WRKY基因调控相关抗病基因的直接证据目前还没有，但是由于OsNH1和AtNPR1的高度同源性[58]，有关OsWRKY45和OsWRKY71的研究已经暗示对OsNH1基因表达水平调控的两种作用模式[13, 28]。比较OsWRKY71和OsWRKY45的相关结果后，我们发现这两个水稻基因很可能都处于SA相关的信号通路中，但前者对抗病信号的调控依赖于NH1而后者不依赖。除了在高表达OsWRKY71的转基因水稻中检测到NH1基因和PR1基因显著增强以外，在OsWRKY12和OsWRKY13两种转基因水稻中也发现NH1基因和PR1基因显著增强[26, 27]，这些结果都说明这三个水稻WRKY基因很可能处于抗病信号途径中NH1的上游。此外，还有报道在研究功能基因的过程中发现其启动子区有较多W盒，很可能受到WRKY基因的调控。如OsWRKY71可以结合在Amy32b基因启动子区的W盒上[51]。水稻倍半萜环化酶基因OsDTC2的启动子区就有6个W盒(−1709 bp 至 −1450 bp)，作者推测水稻WRKY转录调控因子对其具有调控作用[59]。最后，一些研究则关注了调控WRKY基因的上游基因，发现OsWRKY13很可能受PRE2和PRE4蛋白的调控，这种调控也建立在OsWRKY13启动子区的特异序列上[37]。

　　4. 水稻WRKY转录调控因子和拟南芥WRKY转录调控因子功能的相互印证及研究展望

　　生物信息学的研究过程中，无论是多个物种间WRKY序列的比较，还是单个物种内WRKY序列的进化树构建，都以WRKY基因的分子进化思想为基础。从低等植物苔藓(Physcomitrella patens)和蕨类(Ceratopteris richardii)到高等植物拟南芥和水稻都发现WRKY基因[60]，另外在原生生物蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)和细胞粘质霉菌盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)基因组中也发现WRKY基因[23]，因而WRKY蛋白也就不能称之为植物特有的了。有意思的是，无论是在蓝氏贾第鞭毛虫和盘基网柄菌中还是在苔藓和蕨类植物中，发现的WRKY蛋白基本上都含有两个WRKY结构域，而在拟南芥(66/72)和水稻(89/103)中的大多数WRKY蛋白则只含有一个WRKY结构域。这一发现暗示WRKY蛋白的进化关系是由含有两个WRKY结构域的蛋白向含有一个结构域的蛋白进化。基于这一思想，我们可以在多个物种间建立WRKY蛋白的进化关系。我们认为通过序列的比对可以部分地预示两个物种间存在近缘关系的WRKY蛋白具有相似的生物学功能，而这种功能相似性的确定需要分子生物学和遗传学的进一步证明。而目前已经有报道提及拟南芥WRKY蛋白、水稻WRKY蛋白以及其他物种的WRKY蛋白的功能存在一定的相似性。结合本实验室的发现，我们把相关的WRKY蛋白在表2中列举。

　　就目前的研究而言，已经发现植物的WRKY基因受多种生物逆境因子包括病毒、细菌、真菌、卵菌、线虫、以及昆虫等[60, 61, 62]和多种非生物逆境因子如低温、高温、干旱、高盐、光(辐射)、高湿、以及损伤等诱导[5, 63]。同时发现植物的WRKY基因在不同发育阶段和生理状况如休眠、开花、胚胎发育、衰老、饥饿等情况表达[4, 64]。另外，植物的WRKY基因表达水平受不同的激素和信号分子包括脱落酸、赤霉素、生长素、水杨酸、茉莉酸、以及一氧化氮和双氧水处理而变化[51, 61, 63, 65]，并广泛参与了水杨酸、茉莉酸、脱落酸、赤霉素、生长素等相关的信号网络[11, 22, 65]。目前许多研究结果证实，不同的激素信号途径存在广泛的交叉[66]，特别是植物抗病反应(SA途径)、植物耐逆反应(ABA和ROS)与发育(GA和Auxin)信号途径的交叉。如我们克隆的WRKY基因OsWRKY45和OsWRKY72[14, 19]与报道的OsWRKY71[33, 51 ]、OsWRKY31[20]和OsWRKY89[30]，它们的表达变化不仅影响转基因植物的耐逆性，而且也改变了转基因植物的抗病性或生长素相关的生长发育。由此我们认为，对水稻WRKY转录调控因子的研究应该运用高表达和高抑制两套系统全面的考察转基因植物的生理发育、耐逆性变化和抗病性变化，进而更加确切的诠释该基因的功能。