超高效液相色谱

由以上讨论中，可知在HPLC分析中，使用粒度dp为5～10μm固定相，色谱柱长10～25cm, Δp为3～10MPa，就可获得n≥3000的柱效，使用大多数有机溶剂或水作流动相，可在2～30min内，实现大多数不同组成样品的分析要求。上述结论是在20世纪80年代末期获得的，90年代后，液相色谱使用了粒度dp＝3.5μm的固定相，2000年很道了使用dp＝2.5μm的固定相，由于高压愉液泵提供压力的限制，实现了仅用色谱柱长为3～5cm的快速分析。直至2004年美国Waters公司在匹茨堡会议上展出了最新研制的ACQUITY超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatographay，UPLC)，它使用dp仅为1.7μm的新型固定相，色谱仪提供的Δp达140MPa（2000psi），可使在常规高效液相色谱需要30min时间的样品分析在超高效液相色谱短短为仅需5min，.并呈现出色谱柱柱效达20万块/m理论塔板数的超高柱效。

UPLC保持了HPLC的基本原理，全面提升了液相色谱的分离效能，不仅提高了分辨率，也使检侧灵敏度和分析速度大大提高、使液相色谱更高水平上实现了突破。因此，必将大大拓宽液相色谱的应用范围，井大大加强了UPLC在分离科学中的重要地位。

一、超高效液相色谱的理论基础
在高效液相色谱的速率理论中，范第姆特方程的简化表达式（7-23）：

如果仅考虑固定相的粒度dp对H的影响，其简化方程式可表达为

此时范第姆特方程式的H-u曲线，由图7-14所示



对由粒度dp分别为10μm、5μm、3.5μm、2.5μm和1.7μm固定相填充的色谱柱，对同一实验溶质测定的范第姆特方程式的H-u曲线如图7-15所示。

这些曲线表达了HPLC技术从20世纪70年代至2004年所取得的快速进展。
由式（7-35）可明显看到，随色谱柱中装填固定相粒度dp的减小，色谱柱的H也愈小，色谱柱的柱效也越高。因此，色谱柱中装填固定相的粒度是对色谱柱性能产生影响的最重要的因素。
具有不同粒度固定相的色谱柱，都对应各自最佳的流动相的线速度。在图7-15中，不同粒度的范第姆特曲线对应的最佳线速度为：

由上述数据表明，随色谱柱中固定相粒度的减小最佳线速度向高流速方向移动，并且有更宽的优化线速度范围。因此，降低色谱柱中固定相的粒度，不仅可以增加柱效，同时还可增加分离速度。

但是，应当看到在使用小颗粒的固定相时，会使Δp大大增加，使用更高的流速会受到固定相的机械强度和色谱仪系统耐压性能的限制。然而，只要使用很小粒度的固定相，只有当达到最佳线速度时，它具有的高柱效和快速分离的特点才能显现出来。

因此要实理超高效液相色谙分析，除必须制备出装填Δp＜2μm固定相的色谱柱外。还必须提供高压溶剂输送单元、低死体积的色谱系统、快速的检测器、快速自动进样器以及高速数据采集、控制系统等。上述这几个单独领域最新成果的组合，才促成超高效液相色谱的实现。

二、实现超离效液相色谱的必要条件
UPLC的实现表明液相色谱已进人超越HPLC的崭新时代。它使液相色谱的分离效率和分离速度在性能上达到了新的高度，这是依靠Waters公司在以下几个方面取得的技术进展。

1.高柱效的ACQUITY UPLC色谱柱
应用“杂化颗粒技术”（hybrid particle technology，HPT）合成了新型全多孔球形1.7μm反相固定相，并制备了高柱效的ACQUITY UPLC色谱柱。

UPLC系统的心脏是色谱柱，为实现UPLC潜在的分离度、分离速度和灵敏度，必须制造出耐高压的反相填料，以充分显现UPLC的全新特性。

Waters公司在1999年使用制备硅胶反相整体柱的原料四乙氧基硅烷（TEOS），利用“杂交颗粒技术”与1/3的甲基三乙氧基硅烷（MTEOS）进行杂化交联，合成了全多孔球形2.5μm、3.5μm、5μm、7μm，孔径12.5nm的HPLC的反相填料——XTerra。由于甲基基团存在于基体杂化颗粒的表面和内部，使其化学稳定性大为增强，适用pH值范围达2～12，进行的交联反应为:

反应后生成的有机-无机杂化颗粒－甲基聚乙氧基硅胶全多孔球形填料。其经十八烷基三氯硅烷表面而改性和三甲基硅烷封尾后，制成商品牌号为XTerra的反相固定相，它出现后迅速获得广泛应用，其基体立体结构如图7-16所示。