紫外-可见光谱采集及导数处理

在普通吸光光度法中，如果吸光度很小，就不能得到精度很好的信号；如果其他组分的吸收重叠在吸收峰上，测定就会受干扰。导数光谱法有可能克服这些困难。近几年分光光度计的发展,使很多仪器具有全波长扫描和导数光谱处理功能,使导数光谱有了更快更好的发展。
导数分光光度法对吸收强度随波长的变化非常敏感,灵敏度高.对重叠谱带及平坦谱带的分辩率高,噪声低.导数分光光度法对痕量分析,稀土元素,药物,氨基酸,蛋白质的测定,以及废气或空气中污染气体的测定非常有用。
但此法的关键是如何采集光谱图和进行导数处理问题,本文就导数光谱采集问题中的影响因素进行深入的分析和探讨,并对导数处理过程中的波长差和标尺因子进行研究,得出了采集导数光谱的最佳条件。
1 综述
数据集的导数处理需要三个参数：阶数、波长差和标尺因子。导数处理后的数据集显示在一定范围内数据的变化率，通过处理可能发现隐藏的峰。选择操作 > 处理> 转换 > 导数，然后在方法面板中给出导数的阶数、X 值的大小 ( 波长差)和标尺因子即可。( 为了显示所有的选项也许需要放大方法面板。)
阶数：选择平滑、1st、2nd、3rd 和 4th 阶。
波长差：给出进行平滑或导数计算时使用波长组合的点数。点数越大将越平滑。
标尺因子：输入一个乘积因子，便于观察导数数据。
平滑和导数计算使用 17 个数据点的卷积函数。导数计算的波长和时间差值四段可选，取决于平滑的间隔。间隔的 X 差越大，噪声越小，但是得到谱图的分辨率也随之减小；因此，选择的波长差要权衡折衷考虑噪声和分辨率。
导数值的计算需要使用中心点前后两端的数据点，这意味着导数或平滑图谱不能得到图谱范围两端的数据，各端要损失一部分。尽管图谱的初始单位是吸收值和透射率。导数的单位则
导数        光谱        时间扫描
1st        Abs/nm或T%/nm        Abs/time或T%/time
2nd        Abs/nm2或T%/nm2        Abs/time2或T%/time2
3rd        Abs/nm3或T%/nm3        Abs/time3或T%/time3
2仪器与试剂
2.1仪器
UV-2550型紫外可见分光光度计（岛津有限公司）
3试验方法
以2μg•mL-1纳他霉素溶液测定样品溶液,分别对扫描速度和采样间隔分别进行试验,得出最佳采集条件。
3.1扫描速度
UVPROBE 软件提供了四种扫描速度，分别是低速(very slow)、慢速(slow)、中速(medium)、高速(fast)。本试验采用了上述四种速度进行扫描。仪器条件为：采样间隔0.5,光谱带宽 2.0nm,氘灯转换波长360nm,扫描方式为自动。测定结果见表1:

从中间截取一段图,比较结果见图1:

以上数据表明:在没有特别精确要求下,中速、慢速、低速扫描基本没有区别,但和快速扫描的区别比较大。从扫描时间和氘灯使用寿命等因素考虑，建议采用中速扫描。
3.2采样间隔
采用0.05为采样间隔时，仪器以0.05nm为单位进行扫描，即自动在1nm范围内插入1/0.05=20个点。其它条件不变。仪器条件为：扫描速度为低速，光谱带宽2.0nm,氘灯转换波长360nm,扫描方式为自动,结果见表2:

从上表可以看出 , 0.05~0.5的采样间隔对最大吸收波长基本没有影响，但1.0和2.0的采样间隔则影响比较大。从图上可以看出,采用0.05、0.1、0.2、的采样间隔,其谱图平划,而0.5、1.0、2.0的采样间隔,其谱图都不是非常平滑。所以，在没有特别精确要求下, 采用0.05~0.2的采样间隔均可，但0.5、1.0、2.0的采样间隔则对测定结果有一定影响。从扫描时间和氘灯使用寿命等因素考虑，建议采用0.2 的采样间隔。
3.3光谱带宽
从理论上讲，光谱带宽越小，波长越接近单色光，但带宽太小，将使单色光的强度减小，使光电流信号减弱，降低信噪比。

4 导数光谱的处理
4.1阶数的选取
有文献指出,n阶（n＝0～4）导数吸光光度法的灵敏度是按4.5n倍增大。分辨率得到了很大的提高,且用微分求导,能显示出吸收峰微小的变化,其谱图如图4~7所示:

随着导数阶数的增加,谱带变的尖锐,分辨率提高,但原吸收光谱的基本特点逐渐消失。在同一波长处有两个物质同时有吸收的情况下,此时的谱图为两物质叠加在一起的吸收峰。所以,在阶数的选择上,要选择能分辨两个或两个以上完全重叠或以很少波长差相重叠的吸收峰的导数光谱图。还要能够分辨吸光度随波长急剧上升处所掩盖的弱吸收峰或能确认宽阔吸收带的最大吸收波长。基于以上三个因素,综合考虑选择导数的阶数。
4.2波长差
波长差给出了进行平滑或导数计算时使用波长组合的点数,点数越多越平滑。 导数计算的波长和时间差值四段可选，取决于平滑的间隔。
波长差有10.000,20.000,40.000,80.000可供选择,随着波长差的增大, 噪声越小,导数光谱图也越来越平滑,，但是得到谱图的分辨率也随之减小,光谱图上的特征吸收峰也随之而减少。因此，选择的波长差要权衡折衷考虑噪声和分辨率。所以,在一个导数光谱图吸收峰小于10个的情况下,建议使用的波长差为10.000;若吸收峰很多,尤其是小峰包很对的情况下,可以适当的调整波长差。
4.3标尺因子
输入一个乘积因子，便于观察导数数据。所以,标尺因子对导数光谱图的分辨率和噪声没有影响,但使导数值成标尺因子倍数增加。当某物质4阶以上的导数光谱纵坐标很小的时候,可以相应的输入一个标尺因子,扩大导数光谱图的可视性。
5结论
通过对以上条件的优化,确定了采集导数光谱的方法,对导数光谱在测定组分具有指导意义。