如何利用LC-MS/MS，更快更好的建立生物样品分析方法?

一、色谱-质谱条件的确立
1、质谱条件的确立
当使用液质联用仪对某一个化合物进行定量分析时，我们就需要建立一个质谱分析方法。虽然仪器的型号不尽相同，但原理却是一致的。我们在确定方法时，主要考虑以下几个因素：

（1）化合物的性质： 包括化合物的结构、化合物的极性及化合物的pKa值。首先了解化合物的结构，我们可以大概的推断其碎片离子的断裂方式，选择较为稳定的碎片离子作为定量反 应的子离子，也可以根据经验判断选用哪种source更为合适；根据化合物的极性大小，我们可以选择一种或几种恰当的溶剂作为溶媒，既能保证完全将样品溶 解，又能提高化合物的质谱响应；而清楚化合物的pKa值，有助于我们选择流动相的添加剂及其pH值，从而提高质谱响应。

（2）流动相添加剂的选择： 在液相-紫外检测中，我们使用的添加剂的种类繁多，可以是挥发性的酸或者碱（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不易挥发的缓冲盐（如磷酸二氢钠-磷酸缓冲 液、磷酸二氢钾-磷酸缓冲盐）。但是在液质分析中，基于质谱检测的原理，我们只能使用可挥发的酸碱或缓冲盐，那么种类就会受到极大的限制。在日常分析中使 用到的添加剂主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐，见图1。三乙胺在紫外检测中，常作为扫尾剂，但是在液质检测中是绝对禁止的。因 为三乙胺进入质谱后不易清除，残留及其严重，能够抑制离子的响应。一旦三乙胺用量增加，时间延长，那么慢慢地质谱就不能灵敏的检测化合物了，所以这点大家 要注意，尤其对于液质的初期使用者。

图1


（3）质谱离子源的选择：质谱出现早期，主要有电子轰击源（EI）、化学电离源（CI）、电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源 （APCI）。但随着科学技术的进步，源的发展也是日新月异。目前，用于定量的离子源主要是电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源(APCI)，他们 的使用范围如图2-1所示。

图2-1

ESI源是液相离子化，主要用于分析极性比较大的化合物及大分子化合物；而APCI源是气相离子化，主要用于分析极性较小的小分子化合物。区别如图2-2所示。

图2-2

在掌握以上基本信息后，根据各个型号仪器的标准操作规程（SOP）进行操作，对各个参数进行优化，从而确定质谱分析方法。

2、色谱条件的建立

在 液相色谱紫外检测中，要求化合物之间的分离必须达到完全分离，即R》1.5，如果进行定量，那R最好≧2.0，这就给分析工作者提出了很高的要求——准确 的配制流动相，精确的调好流动相的pH及添加剂的浓度。但在液质分析中，我们经常使用多反应监测（MRM/SRM）对化合物进行定量，由于MRM要求选择 两次离子，因此它具有很高的专属性，基于这点我们对多个化合物同时进行检测时，不需要彼此间达到完全分离就可以对他们进行定量分析。但这里需要强调的一点 是，由于生物样品中含有大量的基质，这些基质的存在会严重的干扰和影响化合物的测定，因而我们需要利用色谱将化合物与基质分开，从而降低基质效应的影响， 即降低离子抑制。

二、内标的选择检测时使用内标物的目的是消除操作误差，因此我们在进行生物样品分析时 必须选择一个合适的化合物作为内标物。LC/MS/MS法的高专属性使其对内标物与待测物的色谱分离要求不高，但要求内标物色谱行为及提取回收率，尤其是 质谱信号响应与待测物的接近；要求在测定过程中内标物受系统误差及碰撞压力变化的影响与待测物一致。所以理想的内标物应为待测组分的同位素标记物，但由于同位素标记物价格非常昂贵且不易获得，我们尝试选用结构相似的化合物（或者同系物）作为内标物。

三、样品预处理方法的选择

根据前人的经验，我们在生物样品预处理中，经常使用到的方法主要有以下三种——沉淀蛋白法（PPT）、液液提取法（LLE）和固相萃取法（SPE），而这三种方法的选择，主要取决于化合物的特性。

分析极性比较大的化合物，优先考虑使用沉淀蛋白法，这种方法操作简单，省时省力；缺点是生物基质中内源性物质去除的不彻底，基质效应较大，使得方法灵敏度不高。

分析极性较小的化合物，我们可以选择液液萃取法，这种方法根据相似相溶的原则进行分离提取，优点在于处理完的样品较干净，内源性物质去除彻底；缺点在于消耗有机试剂的量很大，对操作人员、环境的污染也大。

固 相萃取法，在国外使用尤为广泛。它采用固相萃取小柱作（见图3）为分离媒介，小柱中添加了不同填料的固定相，如以键合硅胶为基质的如C18、NH2、 COOH、PSA、SAX等，是硅胶的表面活性大为降低，最大程度的降低了极性化合物的不可吸附和拖尾，使样品回收率和重现性得到保障；以高分子聚合物为 基质的如PEP、HXN、PAX、PCX等，具有高纯度、高比表面的特点；以吸附型填料为固定相的如硅酸镁、氧化铝等，主要通过表面的极性吸附达到分离的 目的。因此，固相萃取法适用于各种极性的化合物，样品处理过程中使用的设备（见图4）简单，柱子活化便捷，基质效应低；缺点是价格昂贵，不太适合我国目前 的国情。近年来又出现了96孔板的固相萃取小柱，可以批量处理样品，耗材少，耗时短，大大提高了工作效率。

图3-1

图3-2

图4-1

固相萃取使用的设备

图4-2

四、实例
下面以全反式维甲酸为实例来简单的说明色谱-质谱方法建立的过程，以及样品预处理过程中注意的事项。
首先，全反式维甲酸的结构式如图5所示，其主要理化性质为：易溶于DMSO，溶于乙醇，微溶于水；对热不稳定，见光易分解。 从上述信息我们可以大概的了解——配制溶液时，溶媒我们应选择无水乙醇，其价格便宜，毒性小，而且溶解性也能满足要求；从结构式来看，由于含有羧基，我们 在检测时应使用负离子模式，而且在进行MRM监测时，碰撞能量不能太大，这是因为能量大将不能形成稳定的碎片离子；再者，由于在支链上含有共轭双键，这决 定了维甲酸的不稳定性，因此，我们在进行样品处理时就必须注意操作环境。

图5

掌握以上信息后，我们使用waters公司的UPLC-Quattro Micro Mass联用仪对该化合物的质谱条件进行了优化，采用注射泵直接进样，优化后的参数如下：Capillary（毛细管电压）：-3.0 kv；Cone（锥孔电压）：-40 v； Collision（碰撞能）：18 ev；其定量离子反应为：m/z 299.5 →m/z 255.2。
确定质谱条件后，我们对色谱条件进行了优化。在这里最主要的是根据化合物的极性大小选择合适的色谱柱，由于该化合物含有羧基，极性相对较大，我们就选用 C8填料的色谱柱为分离媒介。同时为了有助于化合物的离子化，加入一定浓度的乙酸，对峰型的改变也有一定程度的作用。
色谱质谱条件确定后，就需要考察一下样品的提取条件。当时我们考察了沉淀蛋白和液液提取两种方法，前者基质效应明显，背景噪音很大，不能满足我们测定的灵 敏度；后者得到干净的复溶液，并能满足我们的测定要求。但在使用液液提取时，有一个问题出现——全反式维甲酸转化成顺式维甲酸、多种氧化产物，这对我们的 测定非常不利。考虑到全反式维甲酸对光、热的不稳定性，我们在进行样品预处理时，选择了避光、冰浴上操作，这样就可以有效的降低全反式维甲酸的转化。样品 经上述方法处理后，进样分析，得到的色谱图如图6所示。

图6

五、仪器使用维护经验

1.严格按照仪器的SOP进行操作，否则容易引起仪器故障；

2. 对液相使用熟练的操作人员，在使用液质时尤其要注意三个方面的问题：一是液质的流速不能太大，若流速太大对于ESI源而言不易于离子化，而APCI源流速 可以在0.5——1.0mL/min；二是流动相的添加剂，不管是缓冲盐还是酸、碱，必须是易挥发的，否则容易堵塞管路和源内的毛细管；三是在液相操作 中，我们经常使用三乙胺作为扫尾剂，但是在液质中尽量不使用三乙胺，使用前请咨询工程师，看看三乙胺的浓度不高于多少对仪器影响甚微；

3.定期清洗离子源，尤其在使用沉淀蛋白法处理生物样品时，离子源很容易脏，定期清理可以提高灵敏度。再者每天做完样品分析后，要及时清洗液相系统，及时冲洗和吹扫管路；

4.机械泵的震气，这个可能只有waters的仪器需要。震气是为了将机械泵及其管路内的灰尘颗粒清除出去，以提高灵敏度；

5. 去污剂、表面活性剂会产生离子抑制现象， 表面活性剂产生的加合物和离子簇会干扰质谱数据，因此不要使用洗涤剂清洗玻璃器皿等容器，如果一定要用，建议超声清洗多次。

附图：

生物样品分析中经常使用的仪器

1.纯水机

2.混匀器

3.真空干燥器

4.LC-MS/MS