此处介绍蔬菜中维生素K1的测定方法(HPLC法)和食物及饲料中水溶性维生素K3(甲萘醌)的测定方法
一、蔬菜中维生素K1的测定方法-HPLC法
1.原理
蔬菜中的维生素K1经有机溶剂提取后，经失活的磷酸盐处理过的氧化铝色谱柱进行净化，再用液相色谱法将维生素K1分离并进行定性定量测定。
2.适用范围
本标准适用于各类蔬菜、绿色植物及其干制品中维生素K1的测定。
3. 仪器：
(1) 实验室常用设备
(2) 打碎机
(3) 202-R型恒温干燥箱
(4) 色谱柱：为0.8cm×30cm的玻璃柱，底端收缩变细，并装有活塞，活塞上约1
cm处有一玻璃筛板，筛板孔径为16～30μm，柱上端膨大为容积约30ml的储液池。使用前需干燥
(5) 旋转蒸发器
与旋转蒸发器配套的旋转蒸发瓶：具塞，圆底，容积为150ml。
(6) 恒温水浴锅
(7) 高纯氮气
(8) 高速离心机
与高速离心机配套的小离心管：具塞，容积为1.5～3.0ml。
(9) 紫外分光光度计
(10) HPLC：高效液相色谱仪，带紫外检测器
4.试剂
除特殊说明实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯，有机溶剂使用前需重新蒸馏。
3.1 无水硫酸钠：使用前需在150℃的烘箱内烘烤4～8小时，以去除水分。
3.2 0.14mol/L Na2SO4溶液：称取20g无水硫酸钠，用蒸馏水溶解后定容至1L。
3.3 丙酮：分析纯。
3.4 石油醚：沸程30～60℃，分析纯。
3.5 0.6mol/L碘化钾溶液：称取10g碘化钾，用蒸馏水溶解定容至100ml。
3.6 5g/L淀粉液：称取0.5g可溶性淀粉，用水溶解定容至100ml。
3.7 乙醚：分析纯。不含过氧化物。
(1)
过氧化物的检查方法：用5ml乙醚加1ml0.6mol/L碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色。或加4滴5g/L淀粉液，水层呈蓝色。则该乙醚含有过氧化物需处理后使用。
(2) 去除过氧化物的方法：重蒸时瓶中加一段纯铁丝，弃去10%初馏液和10%残留液。
3.8 洗脱液：石油醚+乙醚(97+3)。
3.9 甲醇：优级纯。
3.10 正己烷：优级纯。
3.11 磷酸氢二钠：分析纯。
3.12 中性氧化铝：100～200目。
3.13 氧化铝的处理：
(1)
磷酸盐处理氧化铝：取250g中性氧化铝，20g磷酸氢二钠，1.6L蒸馏水，放入容积为2L的锥形瓶中沸水浴30min，不时摇动或搅拌。冷却，倒掉上层液体(包括悬浮的细小颗粒)，然后用布氏漏斗抽滤。将残留物转至平底玻璃皿中，于150℃干燥箱中烘烤3～5h至两次称量相差3g以下，烘烤过程中不时搅拌，以避免结块，冷却后放入干燥器中保存。
(2) 失活处理氧化铝：使用前，将磷酸盐处理的氧化铝，加入具塞锥形瓶中。每100g氧化铝加9.0ml去离子水，盖紧瓶塞，蒸汽浴或80℃干燥箱加热
3～5min，剧烈摇动锥形瓶，使氧化铝可以自由流动，无结块。冷却，静置30分钟，使水分分布均匀。
(3)
验证处理过的氧化铝：取标准应用液1.0ml，用氮气吹干，再用石油醚溶解定容至1.0ml。然后按5.3装柱，将标准溶液加入柱上，按5.4净化步骤进行柱色谱，用旋转蒸发瓶收集洗脱流出液，浓缩，氮气吹干，用正己烷定容至1.0ml，HPLC测定，记录峰面积或峰高(A)。另取标准应用液直接测定，记录峰面积或峰高(Ar)。将A与Ar进行比较，其值在0.97～1.03之间(A/Ar)，则说明柱效较好，氧化铝处理合格。否则需重新进行失活处理。如果再次验证比值仍不能达到0.97，则需重新制备氧化铝。
3.14 维生素K1标准：Sigma公司，纯度>98%。
3.15 标准贮备液：精确称取50.0mg维生素K1标准，用正己烷溶解定容至50.0ml，即1.0mg/ml。将储备液分装成安瓿，冷冻保存。
3.16 标准工作液：取标准贮备液， 用正己烷准确稀释50倍, 即20.0μg/ml。
标准工作液的标定：取标准应用液测定紫外吸光值，波长248nm，比色杯厚度1cm，以正己烷为空白，测定3次，取平均值，按下式计算标准应用液浓度。
X1 = | A | ×M ×103 | ……………………………………(1) |
式中： X1 -- 维生素K1标准应用液浓度，μg/ml;
A -- 标准应用液平均紫外吸光值;
E -- 摩尔消光系数，20,000;
M -- 维生素K1分子量450.7;
103 -- 换算成μg/ml的换算系数。
