量子点成像的新研究进展

　　1 引 言

　　生命科学的飞速前进离不开新技术新方法的应用。荧光显微成像技术出现后，人们对于细胞内精细结构、细胞间相互作用、细胞信号转导及大分子蛋白的作用有了更深入的了解。研究人员不断致力于新的荧光成像技术和荧光探针的开发和研究，但有两大难题一直横亘在探索的道路上：一是无法有效的克服细胞在可见光区的自发荧光对标记分子所发信号的掩盖;二是由于荧光有机染料分子易发生光漂白，无法较好的实现对所研究分子的长时程荧光标记观察[1]，这就迫切需要出现一种有强大的、持续的荧光效应能掩盖细胞的自发荧光且具有抗光漂白作用的新的荧光物质。量子点的许多光学特性恰可以解决这两个问题，而且其尺寸特点也使得它非常适于在生物荧光成像中做荧光标记物。量子点的出现特别是其在生物学中的应用给生命科学众多领域的研究带来了曙光，也已成为研究的热点之一。许多关于量子点在荧光成像中应用的综述性的文章都对此进行了系统评述和深入探讨[2～14]。近两年来，随着新一代量子点技术的开发，量子点得到了更广泛的应用，在荧光成像方面展示出无穷魅力，得到了许多非常有意义的结果，在生命科学中发挥了越来越重要的作用。本文除介绍量子点的基本性能外，重点就2004～2005年量子点研究的新进展进行了综述。

　　2 量子点的特性

　　量子点(Quantum Dot,QD)，是一种由ⅡⅤI族或ⅢⅤ族元素组成的,直径在1～100 nm之间的半导体纳米颗粒。Grecco等[4]曾就量子点光学特性进行了较详尽的综述，包括双光子激发、荧光寿命检测、总体和单个量子点发射向异性、量子点作为供体进行荧光能量共振转移(FRET)、高亮度光照下量子点光谱的变化等。与传统有机荧光分子相比，量子点具有许多的优点，使其可以更好的应用于光学成像中：量子点的激发光谱较宽且呈连续分布，而发射光谱宽度狭窄(半峰宽20～30 nm)且呈对称分布，可减少光谱重叠，使同时区分多重荧光团成为一种可能[15];颜色可调，即不同大小的量子点能被单一波长的光激发而发出不同颜色的光,其发射波长从400 nm到2 μm不等,可同时实现同一细胞多色标记成像[16]。量子点为多电子体系，因此荧光效率高于单个分子。光化学稳定性强，一般会持续发光几百纳秒，在某些情况在其发光时间可达染料分子的100倍，显著提高了检测灵敏度并延长活体成像的检测时间[14]。此外，量子点较有机荧光染料更不易降解，能抵抗生物活体内的代谢降解作用，几乎无细胞毒性，在活体内及细胞内长时间存在，不会对实验动物及细胞造成很大的伤害[17～19]。生物标记光学成像中，量子点标记分子与靶分子相互作用配合灵敏性较高的荧光显微成像系统，如共聚焦激光扫描显微镜[20]、多光子显微镜[21]、核磁共振[22]等，可实现对活体组织及细胞的深层定位及相应的病理生理检测。

　　3 荧光成像的应用

　　3.1 活细胞荧光标记及组织光学成像

　　细胞生物学中一个重大的突破就是活细胞成像。细胞或细胞组分成像的标准方法是用荧光物质对相关部位进行标记，量子点作为纳米尺寸的晶体，有着独特的光化学和光物理学特性，使其不仅适合单分子成像，也可以进行组织整体的成像研究[9]。量子点标记技术在初期已被广泛应用在固定细胞的荧光成像方面[1]，而活细胞成像中大多局限在细胞膜受体定位和细胞质的研究中。Chen等[23]首次报道了将量子点与标记分子复合物通过转染进入细胞核，在实验中他们将量子点与SV40(猴病毒40)大的T抗原核定位信号(NLS)结合，并经转染进入活细胞，通过荧光成像系统监测到复合物从细胞质到细胞核的运动过程，经1星期以上时间的培养观察没有发觉对细胞有负面影响。长时间观测可以看到复合物堆积在细胞核中。这一工作首次将量子点用在细胞核中进行长时程观测生物现象，提供了一种新的无细胞毒性成像技术来研究细胞核的交换机制及过程,使细胞核的研究工作提高到可视化程度。量子点颜色的可调性，使其可实现同一细胞的多色标记。有研究表明[24]，可同时用发红色荧光的量子点标记细胞核、发橙黄色荧光的量子点标记高尔基体、发绿色荧光的量子点标记微管，经单一波长的光激发后,3种颜色同时显现，这是常用的标记物和荧光染料所无法做到的，足以可见量子点生物应用的广阔前景。

　　量子点在活细胞成像中的应用除细胞核外，还被用于细胞内源蛋白[19]、表皮蛋白[25]、细胞内组分[26]、及细胞内外受体运输途径[27,28]的研究。量子点进入细胞的途径也可以不经修饰而通过转染技术,由磷脂脂质体包裹直接进入[22,29]，这种技术增加了量子点的水溶性和生物兼容性;脂质体中的量子点非常的稳定，甚至经过90 min的光照射后荧光强度仍保持在正常的数量级。这种脂质体包裹的量子点除了在活细胞中应用外，还可以用于组织和生物大分子中。

　　组织光学成像是量子点的另一大优势。水溶性量子点外包被生物分子增加了其生物兼容性，可使量子点进入组织进行长时间光学成像，这是众多荧光染料分子所不能比拟的。由于血脑屏障的存在，脑组织中荧光可视成像一直是神经科学研究的难点，量子点却可以突破这个屏障进入脑组织。如量子点与TAT(一种细胞敏感的缩氨酸)连接后，通过动脉进入脑内，几分钟内就标记到脑组织上而不受血脑屏障的影响，用低功率的紫外灯就可以使整个鼠脑的荧光清晰可显。组织学数据显示，除了内皮细胞外，TAT连接的量子点都可到达脑组织，未连接TAT的量子点则不能进入[30]。这一实验证实量子点进入脑组织成像是完全可能的，这为脑内药物靶向递呈研究和神经科学及开发人工智能提供了强有力的工具。

　　量子点活细胞标记成像技术不仅可以用在动物细胞和组织中，还可用于植物细胞中。Ravindran等[31]将与花粉粘着素(SCA，一种花粉管粘着蛋白质)结合的量子点加入到已发芽的百合花花粉颗粒中，在共聚焦显微镜下,对这种蛋白质首次进行了定位观察，为量子点的应用开阔了新的领域。

　　量子点在活细胞荧光标记及组织光学成像中的应用，使我们更深入的了解到不同种类细胞的内部结构、分子运行轨迹及深组织形态学，为生理学研究、药物靶向载体的开发提供了一种新的途径。

　　3.2 肿瘤细胞示踪及诊断影像

　　肿瘤及癌症的诊断和治疗问题是全世界都在关注的焦点。光学成像技术在敏感的肿瘤诊断尤其是在肿瘤的早期诊断阶段有着巨大潜力，这是一项灵敏的、非侵入性、非电离性、临床应用安全、花费相对便宜的技术[32]。在肿瘤转移的研究中，Voura等[33]通过量子点标记和多光子激发、光谱成像，观察到了肿瘤细胞转移到肺组织中的5个入口。

　　子宫颈癌作为高发肿瘤之一，世界各国都在积极开发早期诊断及治疗的方法。目前，量子点已经可成功地使之应用在细胞水平的肿瘤成像上。Nida等[34]将与量子点连接的表皮生长因子受体与抗生长因子抗体形成共轭对来探测子宫颈癌前期生物学标志物，经过适当地控制，观测到准确标记的生长因子受体，结合光学成像技术，显示子宫颈癌在分子水平的变化。该技术有助于肿瘤早期的诊断。

　　量子点还可用于检测肿瘤的血管变化。肿瘤组织周围血管丰富，细胞生长迅速。通常所用荧光试剂不能在体实时对多种组织成像，而多色量子点标记技术可以应用到肿瘤细胞、肿瘤血管及周围区域的边界研究中，从而应用于肿瘤早期诊断和治疗。Stroh等[35]将量子点、多光子成像技术和表达绿色荧光蛋白的转基因老鼠结合研究肿瘤血管周围的细胞和组织。结果证实这些纳米荧光晶体可以实时成像,并可从血管周围的细胞和组织中区分出肿瘤血管。他们还利用量子点标记成功地检测到了干细胞由骨髓补充到肿瘤脉管系统的过程，这为多功能的量子点用于肿瘤病理生理学研究开辟了一条道路。

　　近红外荧光由于能穿透组织进行深层组织成像且自发荧光背景较低，已引起有关研究者的注意，且已将其引入到肿瘤研究中。发射近红外荧光的量子点已经被制备出来，并用于多种疾病的前哨淋巴结(SLN)的定位标记成像，如非小细胞肺癌、食道癌等癌症和胸膜部位疾病等[36～42]。在鼠的前肢皮下和猪的腹股沟皮下注射近红外荧光量子点做为肿瘤细胞淋巴示踪，通过近红外荧光成像系统观察到量子点被引流到前哨淋巴结。该方法是确定癌症是否扩散到身体其他部分的第一步，也是最关键的一步。近红外荧光量子点成像系统可同时显现外科手术区域和淋巴液排泄途径及节点，提供实时可视化成像来指导定位和外科切除术[40,41]，因此克服了许多现有技术的局限性。

　　量子点在识别肿瘤细胞中的研究较多，但用在肿瘤治疗中鲜有报道。量子点的光学特性使其可以作为光敏剂用于光动力治疗中。Bakalova等[43]在2004年报道，用量子点可以简单识别癌细胞与正常细胞，也可以单独将癌细胞杀死而不影响正常细胞。他们将量子点与特异性识别癌细胞的糖结合蛋白(又叫植物凝集素)抗体进行融合，将这种复合物加到癌细胞中，紫外线照射时，癌细胞与这种量子点结合发出绿色的荧光，正常细胞则不能结合亦不能显色，以此可用来区别正常细胞与癌细胞，而且经过持续的紫外线照射，可将癌细胞杀死。数据显示：紫外线照射60 min后，有10%~15%的癌细胞死亡,这仅是量子点在肿瘤治疗方面应用的尝试，相信不久的将来在这方面的研究会越来越多。

　　总之，与传统的有机染料相比，量子点具有的各种独特性质已得到充分的展现和利用，量子点作为荧光标记成像的一种有力工具，值得我们大力展开工作来实现并完善这一工作。本实验室正在研究一些影响量子点多色标记的因素如温度等[44],温度的影响对量子点量子产率有较大的影响，而且对不同颜色或粒径的量子点的影响各不相同。量子点晶体表面的完美性以及表面修饰都因温度的变化对量子产率影响重大，因此，该研究对有关温度变化的单色或多色成像和编码等生物分析具有很强的指导价值。同时，我们还将量子点与单克隆抗CD71抗体结合而制备出具有生物活性的荧光探针，并将此探针与肿瘤细胞表面的转铁蛋白受体结合发生免疫反应而进行细胞成像分析。这一研究将对肿瘤细胞表面进行标记及研究细胞免疫反应所涉及到的诸多问题提供一种有效的解决途径。

　　3.3 动物活体成像

　　动物活体中量子点作为光学对比剂结合荧光成像系统可进行肿瘤的定位，实时监测肿瘤细胞的生长和转移，对肿瘤动力学的研究及指导癌症手术提供了帮助[45]。聂书明等[46]首次实现了用量子点同时在活体内定位和成像。他们用ABC triblock聚合物纳米颗粒层和聚乙二醇包被量子点，将其附着在单克隆抗体上，此抗体连接物可以和前列腺肿瘤细胞上的前列腺特异性抗原结合。这种量子点注射入有前列腺肿瘤的裸鼠循环系统后聚集到肿瘤细胞周围，荧光成像检测可得到在体肿瘤细胞敏感的多色的荧光图，获得肿瘤大小和定位的信息。他们还用未结合抗体的量子点去“被动”的定位肿瘤，发现尽管量子点可以从肿瘤血管上“渗漏”出来并在肿瘤上聚集，但这个过程比结合了抗体的量子点聚集要慢很多，效果也差。这种特别设计的量子点在较宽范围的pH和盐条件下是稳定的，适用于复杂的体内实验。

　　Hoshion等[47]利用量子点通过内吞作用进入小鼠的淋巴瘤细胞。结果显示：量子点标记物在细胞中很稳定，不会影响细胞的活动和功能;被量子点标记的淋巴瘤细胞经尾静脉注入小鼠体内，5 d后，用荧光显微镜和流式细胞仪结合组织切片观察，量子点标记物在外周血中的浓度约为10%。7 d后，在鼠的肝、肾、脾、肺中仍可观察到约20%的标记细胞的初始量子点。Byron等 [48] 将一组4种表面各有不同修饰层的量子点注射入鼠体内，经循环实验发现，表面不同修饰的量子点在体内的半衰期也不同。利用表面材料，可确定量子点在体内的位置;实验结果表明，在体内4个月后，这些量子点仍能发出荧光。

　　在生物实验中，荧光染料的生物毒性也是关注的焦点之一。动物活体实验数据表明，在量子点标记的细胞内及动物体内并未出现异常迹象，由此可以说明量子点荧光标记是一项安全有效的技术，至少在动物活体内如此。量子点作为荧光标记物在长时程追踪活体内的靶细胞时，是非常有用的生物成像工具。动物实验的数据也为量子点进一步在临床的应用积累了经验，研发适合人体组织的光学影像探测系统的量子点将是今后重要的发展方向之一。

　　3.4 激素及生物因子研究成像

　　量子点不仅可以在细胞水平及动物活体中应用，在细胞亚结构中，甚至在激素和生物因子水平也有报道。在原位杂交培植和免疫组化中用量子点结合激光共聚焦扫描显微镜，可观察到三维空间中蛋白质和mRNA的关系。这种方法可显现蛋白质和相关联的mRNA合成和定位的功能性成像。Matsuno[49]利用量子点的特性和激光共聚焦扫描显微镜对生长激素和泌乳刺激素及它们的mRNA进行了三维成像。

　　量子点在各种生物因子中研究最多是表皮生长因子[50，51]。Lidke等[51]将量子点标记到表皮生长因子上，通过激光共聚焦显微镜，观测到肿瘤细胞通过胞吞途径特异性摄取这种表皮生长因子的全过程。

　　量子点通过标记并结合荧光检测系统用于研究激素及生物因子，对生长发育学和内分泌学的研究打开了一个新窗口，提供了一种新的方法。

　　4 前景及展望

　　量子点是新兴的荧光成像材料。高性能的多功能量子点与先进的光学成像技术相结合，为实时地动态地监测细胞内和生物活体内的分子事件提供强有力的实验手段，为揭示生命活动规律及研究疾病的发生、诊断、治疗提供了新技术新方法，极大地促进了生命科学的发展。随着荧光标记研究领域的日益深入，如何提高量子点的生物相容性及对标记物的敏感性、特异性、稳定性及荧光的高效性等多方面的研究，将是下一步的重点。另外，如何更高效地将量子点与识别分子相结合也是一个有待解决的问题之一。然而，尽管在应用中存在着这些难点，量子点作为一种新的荧光标记物仍将为荧光成像带来新的高峰，对细胞生物学、光子学成像及医学领域也将会产生深远的影响。

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