1、如何保持CO2培养箱中水盘的清洁?
CO2
培养箱内底部一般配有一个水盘，用以维持CO2培养箱内的湿度。水盘内的水要定期更换和添加，水盘也要定期清洗以避免微生物的生长。为了减少微生物的污染，有一些CO2培养箱提供灭菌功能。有的可以加热到比较高的温度来灭菌，有的则通过让空气循环通过一个紫外线腔体的办法来灭菌，这样就灭菌时就不需要中断细胞的培养。
2、为什么放置在4oC冰箱中的原代细胞培养基会发生颜色变化?
原代细胞培养基需保存4°C冰箱中。如原代细胞培养基中长生的CO2会逐渐溢出后，造成原代细胞培养基越来越偏碱性(pH大于7.4)。而原代细胞培养基中酸碱指示剂(通常为phenol
red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。原代细胞培养基偏碱后再用于细胞培养将造成原代细胞生长停滞或死亡。原代细胞培养基如偏碱时，可以通入无菌过滤的CO2，以调整pH值。
用新鲜的原代细胞培养基进行细胞培养。
3、购置的血清一定要进行灭活处理吗?
血清灭活处理对大多数的原代细胞培养并非必需的。
高温灭活处理的血清可能带来的问题：
(1)影响血清的质量，此血清造成原代细胞生长速率的降低。
(2)沉淀物的形成增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察时像是“小黑点”，常会误为是原代细胞培养污染。
高温灭活处理的血清放在37°C环境中，沉淀物增多，此非微生物的分裂扩增。
购置高质量、好品牌的血清，无需灭活处理。
4、血清最好的保存方法是什么?
500ml血清需分装保存。
血清长期保存需放置在-20°C。
血清在4℃保存时，请勿超过一个月。
500ml血清分装为每50ml/管，-20°C保存。
5、冻存的血清如何解冻?
血清从冷冻箱取出，放置4°C处24小时，然后放置室温至全融。
冻存血清融解过程中，必须规则地摇晃均匀。
6、为什么解冻血清后有絮状沉淀物出现?如何处理和避免?
解冻血清后有絮状沉淀物并不影响血清本身的质量。
解冻血清后有絮状沉淀物出现主要原因：
(1)血清中脂蛋白的变性所造成;
(2)血纤维蛋白存在于血清中;
处理和避免解冻血清后有絮状沉淀物出现：
(1)解冻后血清离心至絮状物沉淀,上清液过滤;
(2)解冻后血清切勿直接过滤;
(3)解冻步骤：-20°C～4°C室温;
(4)热灭活血清易造成沉淀物增多，多无须此步骤。
(5)热灭活血清原则：56°C、30分钟、摇晃均匀。
冻存血清融解过程或热灭活时，必须规则地摇晃均匀。
7、为什么原代细胞培养生长减慢?
原代细胞培养生长减慢原因：
(1)原代细胞培养基和添加基的配置或选购不当;
(2)胎牛血清质量不高或保存不当;
(3)缺乏或已被破坏细胞生长必需成分：如谷氨酰胺、生长因子;
(4)细菌或真菌等微生物污染;
(5)培养条件不正确如温度、湿度、CO2浓度;
原代细胞培养体系、微生物污染、培养条件三种因素。
8、细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗?
不见得!因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++,
Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下pH8.0、温度37°C其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液浓度为：
(1)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA;
(2)0.25% 胰蛋白酶
多数细胞传代消化可使用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA这种消化液。
9、为什么原代细胞冷冻管经解冻后会发现细胞数目减少或太少?
原代细胞冷冻管经解冻后，再离心是造成细胞数目减少或太少的主要原因。
原代细胞解冻后不要立刻离心。
10、为什么原代细胞培养时需使用5%CO2或10%CO2?
原代细胞培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。
原代细胞培养基使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统。
当原代细胞培养基中NaHCO3含量为每公升1.5g时，原代细胞细胞培养时应使用5%CO2。
当原代细胞培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，原代细胞细胞培养时应使用10%CO2。
原代细胞培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，原代细胞细胞培养时应使用5%CO2。
11、原代细胞培养解冻培养时如何去除DMSO?
除少数原代细胞对DMSO敏感之外，绝大部分原代细胞培养，在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜原代细胞培养基中，隔日再换新鲜原代细胞培养基去除DMSO。
隔日换新鲜原代细胞培养基时，去除DMSO。
12、原代细胞培养出现死亡常见原因有什么?
(1)培养箱内CO2浓度;
(2)培养箱内温度稳定;
(3)培养箱内温度湿度;
(4)细胞冻存过程;
(5)细胞复苏过程;
(6)原代细胞基础培养基;
(7)原代细胞培养添加剂;
(8)血清的质量;
(9)操作人员技术;
原代细胞基础培养基和原代细胞培养添加剂尤为重要。
13、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?
L-谷氨酰胺作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和核酸代谢。
L-谷氨酰胺降解率随保存温度而变。细胞生物学技术服务
L-谷氨酰胺降解致氨形成，氨对细胞具有毒性作用。
使用新鲜的L-谷氨酰胺。
14、原代细胞基础培养基及原代细胞培养添加物可反复冻融吗?炎症检测技术服务
原代细胞基础培养基不要冻融，放置4°C保存。
原代细胞培养添加物最多可以冻融3次。
15、原代细胞培养体系中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗?
原代细胞培养体系中添加了血清和抗生素后，放置4°C保存可使用3-4周。
使用小包装(250ml或100ml)的原代细胞培养体系。
16、如何处理原代细胞支原体污染?
(1)直接对培养原代细胞灭菌后丢弃;
(2)清洁环境;
(3)重新评估原代细胞培养体系的无菌;
(4)重新评估原代细胞培养无菌操作技术;
17、原代细胞冷冻保存应用DMSO的注意事项有哪些?
Sigma D2650 Tissue culture grade用于原代细胞冷冻保存。
DMSO为无菌状况。
DMSO第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C，避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。
DMSO要过滤，须使用耐DMSO的Nylon滤膜。
原代细胞培养时，需购置原装Sigma的DMSO。
