奶粉中双氰胺的检测方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）

上一篇 / 下一篇 2013-01-28 00:23:19

北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。
hV7W V Q0本文采用天津博纳艾杰尔科技的Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（货号：MS-DI5001）和Venusil^® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。

实验部分
{ R \4[2Pc0c0仪器和试剂分析测试百科网4NNdn4o ?^
高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。分析测试百科网$@t2].C%aPY
双氰胺标准品，Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil^® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。分析测试百科网*z piql
实验方法
cd:C qz0提取、净化分析测试百科网mZ t7P9zwH/I
称取1g试样于50ml具塞离心管中，加入2ml水溶解后，加乙腈定容至10ml，超声10min，8000r/min离心5min，取2ml上清液加Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管中，，涡旋0.5min，8000r/min离心5min，取上清液过0.22um滤膜，待测。
}[:l6E6iZT5t&l V0分析测试百科网,I8Z9s X&_}&v:aE
HPLC法：分析测试百科网 J_M$S'_ tn-E9I

X#G"A;ymT)J}9P*\,S%R0色谱条件：
色谱柱：Venusil^® HILIC 5μm 100Å 4.6*250mm；
w6[-?e(SO/~0流动相：A：10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）；分析测试百科网_-B$o'xb6zU0|-O
B：乙腈；分析测试百科网{X4KY;RK8RS
A：B=10:90；
@e@AR0检测波长：220nm；
4[/OvD+Pe0进样量：10µl；
柱温：30℃；
2zk6j{;j0流速：1ml/min。分析测试百科网?M6vg-I7F$}

4IYc/^QG!}&SwN0实验结果：
p?3pQ"{#Ao'p$b/~0线性关系和检出限分析测试百科网i.y"x An ja w)C
准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；
r7}J0w \ z6u`0分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为0.1µg/ml，0.5µg/ml，1.0µg/ml，2.0µg/ml，5.0µg/ml和10.0µg/ml的标准溶液，按照上述色谱条件，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表2：

表2 双氰胺线性方程和定量限（HPLC法）

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	4.92min	Y=116.44X+3.2699	0.9997	0.1µg/ml

分析测试百科网Yi:S^+k2u&UU
检测方法稳定性考察
A4hf5gZZ|ky0选用10.0µg/ml的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表3：

表3 检测方法定性和定量稳定性考察考察（HPLC法）

标号	保留时间，min	峰面积
1	4.930	1061.7
2	4.933	1072.2
3	4.930	1064.4
4	4.929	1079.7
5	4.930	1067.3
6	4.934	1073.6
RSD，%	0.04	0.62

分析测试百科网 Iw9ex2J'T-bgQ
准确度和精密度分析测试百科网mz J+s9}v3u}
选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表4

表4 10µg/g添加回收实验结果（HPLC法）

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
98.6	88.4	89.8	92.3	5.99

分析测试百科网(SQ!Zg `#OkW
LC-MS/MS法：
%}*]'VDB(tA3cvi(Z0
A*X0Kj QY3M0色谱条件：
JK0V*SdE8G)KHh1H0色谱柱：Venusil^® HILIC 5μm 100Å 2.1*150mm；
5c&YU1BJ"^w0流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0）分析测试百科网+D8te*`6[$hm0^I
B：乙腈分析测试百科网^#~Ok,DEI;aY
A：B=10:90
6[G~^p,Cd0进样量：10µl；分析测试百科网m#wZy4x0G`cXM
柱温：30℃；
Rmk*YVCh4\0流速：0.2 ml/min。
&y(f*G"nL]0分析测试百科网(CPI9[F
质谱条件
质谱仪：API 4000+；
离子源：电喷雾离子源；分析测试百科网2z/u#wi Uz
扫描方式：正离子扫描；分析测试百科网'b.d'HyE
检测方式：多反应监测；
X"[kaB N_0CAD：8.00；
I/oG:T,[8s x2c0CUR：10.00；分析测试百科网1|&o]'Tq)Hf_
GS1：60.00；
b+gQAb,L,s9j6M[R0G0GS2：50.00；分析测试百科网Az3e:n pRH
IS：5500.00；
N&qwR{z0TEM：500.00。

表5 双氰胺质谱信息

药物名称	监测离子对	DP	EP	CE	CXP
双氰胺	85/68	71	10	41	6
	85/43	71	10	41	6

注：带“____”的监测离子对为定量离子对。

实验结果分析测试百科网1_6V.O)icK-xb+^
线性关系和检出限
I;b9Ta9gAW0准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液；
O.xxz$d'n0分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml和500ng/ml的标准溶液，按照上述液质方法，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见下表6：

表6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法）

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	3.15min	Y=8777.2X+7435.9	0.9993	5ng/ml

检测方法稳定性考察分析测试百科网;]"@*c6FvL]-s
选用50.0ng/ml的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表7：

表7 检测方法定性和定量稳定性考察考察（LC-MS/MS法）

标号	保留时间，min	峰面积
1	3.29	382950
2	3.30	387950
3	3.25	382840
4	3.31	399820
5	3.30	378580
6	3.30	383810
RSD，%	0.65	1.92

分析测试百科网|H-?}'kgm6y
准确度和精密度分析测试百科网Ou0VS:{7T
选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表8。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

表8 100ng/g添加回收实验结果

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
84.6	80.7	90.2	85.2	5.61

双氰胺检测方法包订货信息

产品名称	规格型号	货号
MAS-QuChERS-双氰胺净化管	100mg/10ml，100支/包	MS-SQA01
Venusil HILIC	4.6*250mm，5μm，100Å	VH952505-0
Venusil HILIC	2.1*150mm，5μm，100Å	VH951502-0
微孔滤膜	0.22μm，直径13mm,200/PK	AM021320
双氰胺对照品	1g/瓶，含量≥99.0%	DCD-0001
离心管	50mL，带螺纹盖，25个/包	L050025-C
一次性无菌注射器	5mL,100/pk	ZSQ-5ML

附图

.Tgx }_ n0图1 定性定量稳定性考察谱图（HPLC法）
x2D\R,X.CJq0
{*u{/zFks1U0图2 双氰胺0.5μg/ml标准溶液谱图（HPLC法）分析测试百科网F,F3N#m2yM9j(HE

ET)h'^M0图3 奶粉空白谱图（HPLC法）分析测试百科网0o5z V [&`

(}i5s4m#E;u$m0图4 奶粉10μg/g空白谱图（HPLC法）分析测试百科网q?-p)j[n\L

*kM}D,cUjX j0图 5 10ng/ml双氰胺标准溶液质谱图

o/kB*H@G9N0图 6 奶粉空白质谱图