摘要：稳定同位素分析在生态学上的应用通常需要抽提大量的植物和土壤样品。随着质谱的发展，水分抽提，而不是同位素分析本身，已经成为了本研究的主要瓶颈。采用低温真空蒸馏技术，我们生成了抽提时间曲线来确定抽提所需要的最佳时间。我们的研究结果表明，植物茎的平均时间是60-75分钟，粘土需要40分钟，而沙土需要30分钟，而叶片需要20-30分钟。本文报道的与以前的文献相比，时间缩短了一些，但是抽提过程仍然是植物水分分析的限速步骤。总而言之，为了提高生态学研究中的同位素分析效率，我们仍然需要改进技术以消除抽提的需要。
植物和土壤水的稳定同位素研究已成为生态学研究的热门方向1,2。主要应用包括植物水来源的确定3、植物对降雨变化的响应4、土壤水分蒸腾与蒸发的区分5以及地下水的补充6等方面研究。研究中，经常需要大量样品分析以匹配自然生态系统中的时空变化。过去40年中，很多抽提技术被使用7，包括机械挤压8，9、采用不融合液体通过离心的方法来替换10、微蒸馏法（锌）11、采用燃料的沸点蒸馏12、低温真空蒸馏9,13,15等。这些方法中，沸点蒸馏和真空蒸馏是应用最广泛的方法。研究表明，两种方法可比性好而且精确。真空蒸馏由于其操作简单，且不需要附加的溶剂而得到越来越多的应用。真空蒸馏期间，水分从样品中蒸发出来并凝结在收集管中。在收集管中凝结的同位素遵循雷利（Rayleigh）蒸馏曲线16，因此，水分的抽提必须完全以获得未分馏水分样品。这消耗大量的时间，往往需要1-16个小时以完全蒸馏9,16-18。实际上，我们或许不需要完全蒸馏。有研究表明，对于沙土而言，收集98%的水分已经可以达到水分不分馏的目标了17。现在还没有其他相关研究，也没有对某一物质抽提所需要的最小抽提时间的研究。生态同位素研究已经扩展到时空尺度。同位素质谱的技术进步已提供了快速而准确的Delat D和Delta18O的分析能力19。作为结果，分析的瓶颈是水分的抽提，而不再是分析本身。提高水分抽提效率将减弱样品处理的瓶颈。本研究确定了植物和土壤样品抽提所需要的最少时间。同时讨论了改进同位素分析效率的潜在方法。
实验
抽提方法与技术描述
本研究采用低温真空蒸馏技术。该仪器包括6个独立的玻璃组件（全固定在1英寸的不锈钢真空管上）(图1)。每个组件包括3/8英寸的玻璃管，连接一个Varian1 801真空表和NUPRO1阀门。固定在玻璃管两端的是收集管(1/2英寸耐热玻璃Pyrex)和抽提管(1英寸耐热玻璃)。所有连接部分采用的是适当大小的Ultra-Torr真空接头或Swagelok接头(见图1的配件号)。整个真空管连接到一个真空泵上（Edwards #5)。
图1 低温真空蒸馏结构图
提取水分样品的时候，先拧下抽提管，把放好样品的小瓶放在抽提管里边。然后重新连接好并浸泡在液氮之中，冷冻样品。对于包含土壤的样品，在样品瓶上包裹玻璃绒以防止其扩散到系统中。小心操作以确保玻璃绒不会影响O形圈和抽提管的密封。一旦样品结冻，就可以利用真空泵抽整个系统以达到60 mTorr的真空度。这个时候，我们需要关闭真空管，利用真空表来监测独立系统中的压力变化。如果真空度保持不变的话，去掉液氮杯，并采用一个含加热元件的充满水的烧杯来加热抽提管。在整个抽提期间，水始终保持沸腾。需要定期补充水以保持正常水位。而液氮杯用来浸泡收集管以冷凝水汽。蒸馏完成后，分别去掉水和液氮。取下收集管，用Parafilm密封条密封并等其解冻。接下来水样品被利用移液管倒入存储瓶以用于同位素分析。来自针叶树种的茎和叶片有时包含有机化合物，这使得水样外表看上去类似牛奶一般，而且有很强的气味。这种情况下，可以加活性碳以吸收这些混合物。接下来过滤以进行同位素分析。在我们的研究中，我们从抽提管放入沸腾的水中的时候开始计时，到收集管取下的时候计时结束。
同位素分析
同位素分析测试在SIRFER实验室进行(University of Utah, Salt Lake City)。水被直接注入温度转换/元素分析仪(TC/EA)，连接到Delta Plus XL同位素质谱仪(ThermoFinnigan) 19。通过这个分析可以获得氢氧同位素比例，同位素比例表达为：
N是E的重同位素比例，而R是重同位素与轻同位素的比值(2H/H或18O/16O)。而Delat是相对于V-SMOW的数值。其精度是1.56% (d2H)和0.19% (d18O)。
抽提时间曲线
我们建立了不同生态学研究对象（土壤、叶片与树木茎杆）的抽提时间曲线，并把抽提时间曲线定义为抽提时间对抽提水的同位素比例的曲线(见图2-4)。当曲线的斜率达到0的时候，将达到稳定的同位素值。我们把Tmin定义为抽提所需要的最少时间。Tmin通过曲线变化视觉判断得出。为了建立这些曲线，我们需要对单一的物质取很多个重复样品（稳定一致）进行抽提。这些样品真空蒸馏不同的时间，再分析其同位素，并做成曲线。
图2. 三种树木茎杆抽提水样的时间曲线 图3. 三种树木叶片抽提水样的时间曲线。
土壤
土壤在70℃下烘干，然后用已知同位素比值的水样混合并接近于野外的实际条件。土壤被均匀混合以确保其含水量的一致性。利用微量瓶收集几个样品，并利用封口膜（Parafilm）密封等待分析。
叶片
叶片样品选自生长良好的Ailanthus altissima，Magnolia grandiflora和Pinus nigra。对于A. altissima的复叶，我们把他们分成小叶，并随机分到不同的小瓶中，每瓶2片小叶，利用封口膜密封。对于M. grandiflora的大叶片，利用塑料袋带回几片叶片，分成小块并混合。在其中随机选择以填充小瓶并密封。对于P. nigra的针叶，不同的针叶取自相同的枝条，随机放在不同的瓶中，每瓶两针，密封用于分析。
茎杆
茎杆样品来自三种木本植物(A. altissima, Juniperus osteosperma和Pinus edulis Englmn.)。茎杆取自发育成熟的第18对枝条。 测试表明在一个枝条的不同部分的同位素含量没有差异。每3厘米的枝条被砍成0.5厘米长的小段，并密封在封口的瓶中。
图4. 来自沙土和粘土的抽提时间曲线
结果与讨论
图2-4显示的抽提时间曲线显示了通常的格局。抽提得到的水的同位素值随时间而上升，直到某一时间变为平稳，不再增加。达到稳定所需要的最小的抽提时间定义为Tmin，其取决于不同的物质而变化（表1）。木材茎杆需要最长的抽提时间(60–75 min)，粘土需要40 分钟，沙土需要30分钟，叶片需要20-30分钟的时间。与Araguas17的研究相一致，我们的数据表明，为了获得基本不分馏的样品，抽提不需要达到完全（100%的回收率）。一旦达到Tmin，样品中仅保留很少的水分；然而为了得到剩余的水分，往往需要额外3个小时的抽提时间。因此，为了得到不分馏的样品，我们不必要进行额外的抽提。三个树种的茎杆的Tmin在60-75分钟之间(Fig. 2)。angiosperm需要最长的时间，75分钟。两种针叶树种大致需要60分钟左右。对于叶片而言，Tmin在20-30分钟之间(图3)。茎杆和叶片的差异主要是因为不同材料中的形态差异。对于茎杆来说，被子植物和裸子植物的气孔大小差异，或木材密度的不同等，都可能影响Tmin。叶片差异可能来自于叶片韧度或质量差异。本文我们没有系统地测试这些假说，需要进一步的研究加一讨论。对于我们选择的研究对象，Tmin的差异明显大于分析过程的精度（表1）。沙土和粘土表现了比较小的差异。前人的研究表明粘土的水样可能因为孔隙水和束缚水的相互作用而产生比较大的问题7,16,17。这个问题在本问的研究中没有明显的表现。
表1本研究中测量得到的不同样品的最小抽提时间(Tmin)
结论
本研究对来自植物和土壤的水的同位素比值的最小抽提时间和波动进行了评价。我们估计木材茎杆中的最小抽提时间是60-75分钟，粘土需要40分钟，沙土需要30分钟，而叶片需要20-30分钟左右。我们承认这些估计可能会由于不同的抽提系统和抽提对象的差异而变动。结果表明样品获取效率可以通过减少时间到最小抽提时间（Tmin）来获得。我们建议本文介绍的方法可以用于其他人寻求不同材料或不同抽提设备所需要的最佳抽提效率的研究。我们也可以通过仔细地设计抽提设备，以实现多样品的同步提取并提高效率。然而最终，我们需要改进新的技术以使得水分的提取技术不再是必须的技术。这样的方法已经用于叶片水分吸收20，但还没有其他方面的研究。这方面的进步将巨大提高水同位素在生态学研究中的应用。
