实验方法篇-组织切片免疫荧光
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下一篇 2010-05-03 10:31:45
徐索文
1.切片自然晾干
2.复水5-10min
3.PBS 5min 3次
4.4%PFA 4度固定30分钟或者冷丙酮4度固定10分钟
5. PBS 5min 3次
6. 滤纸吸干，用免疫组化笔在切片周围画圈
7.1% triton X-100透膜 10min
8. PBS 5min 3次
9.血清封闭30min
10.倾去血清(勿洗)，湿盒内37度孵育1小时或4度过夜
11.室温复温1h（防止掉片）
12. PBS 5min 3次
13.湿盒内37度孵育1小时（避光）
14. PBS 5min 3次
15.DAPI或Hoechest复染细胞核10分钟，PBS漂洗两次，5分钟/次
15.甘油封片，指甲油封固，移荧光显微镜或Confocol观察
Notes：
1. 切完片后，室温下放置30分钟，然后冷丙酮固定，4度，10分
钟。让切片充分贴片，而不至于脱片。一般发生脱片，背景会很重。
2. 片厚小于10um，越薄越好，否则激发光都消耗在片子的底部，而物镜观察的上部激发不明显。
3. 血清封闭10-30分钟，阻断非特异结合点。具体阻断时间，可根据预实验的结果来调整。
4. 注意调节一抗、二抗的浓度和孵育时间，做好预实验。
5. 孵育后，PBS充分洗涤，5-10分钟，3次。
6. 最好选择单抗，如果是多克隆抗体，很可能会有较多的非特异着色点。
7. 二抗孵育及后续洗涤过程过程中，注意避光。
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TAG: 组织切片免疫荧光
