重组蛋白和多肽的分离纯化（8）

目前对于不同的亲和表达纯化系统的比较还不多，亲和纯化的选择还是多根据经验来确定，最近Lichty等以纯度、产率和花费为指标比较了几种亲和纯化标签的纯化效果，认为金属螯和亲和层析容量高，价格便宜，从大肠杆菌提取物中纯化组氨酸标签(His tag)融合蛋白的得率高，纯度中等，从酵母、果蝇和Hela细胞的提取物中得到蛋白的纯度就较低，对于钙调蛋白结合肽(CBP)融合蛋白，从大肠杆菌、酵母、果蝇提取物中纯化的纯度中等，而从Hela细胞提取物中能得到很好的纯度，基于表位的标签FLAG和HPC(蛋白C重链)能从4种提取物中得到高纯度的蛋白，但使用的介质价格昂贵、吸附容量低，Strep tag Ⅱ标签融合可以在中等花费的情况下得到相对较好的得率和纯度(100)，这方面的研究对于选择不同的亲和标签提供了很好的实验基础。在10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ-10-氧-乙酰转移酶(10-DABT)的表达纯化中，Fang等比较了GST系统、6×His系统和PinPoint系统对融合蛋白表达和纯化的影响，6×His融合蛋白在高浓度诱导物条件下的表达水平最高，但只有25% 的可溶性蛋白，一步纯化只得20%的纯度，GST融合蛋白表达水平低一些，可溶性蛋白却占了约80%，亲和层析后纯度为40%，可生物素化标签融合蛋白表达水平最低，可溶性蛋白只占40%，亲和层析后纯度60%，可见不同亲和表达纯化系统对上游、下游各个阶段的影响不一样，需要综合平衡考虑(101)。

当前许多生物的基因组测序已经完成，结构基因组和蛋白质组成为研究的主要领域，需要发展大规模和高通量的技术进行蛋白质的表达、纯化、活性和结构分析。使用原核系统有许多优点，如易于操作、生长快速、表达水平高，但在原核系统真核蛋白常常不能获得可溶性表达，主要的原因有以下几点：1 原核系统没有真核的分子伴侣;2 原核系统不能进行糖基化等翻译后修饰;3 不能进行亚细胞定位;4 没有与其结合起稳定作用的同伴分子。前面我们已经介绍了多种促进蛋白质可溶性表达的方法，但亲和融合策略是适应大规模原核可溶性表达最为行之有效的方法。Hammarström等比较了7 种标签对32种人源蛋白原核表达和可溶性的影响，N端His标签和GST融合蛋白的表达的比率为59%，Gb1(来源于protein G的Gb1 结构域)、ZZ、NusA(抗转录终止因子)和MBP融合蛋白的表达比率在70%-81%，硫氧还蛋白融合蛋白的表达比率达到89%，在表达的27个蛋白(分子量小于20Kda)中，对可溶性的影响顺序如下：硫氧还蛋白~Gb1~MBP>ZZ~NusA>GST>6×His，但其中没有任何一个可以解决所有的可溶性表达问题，所以只有组合应用不同的标签，才能获得高的可溶性表达比率(108)。通过对30个哺乳动物全长蛋白和结构域的融合表达研究，Dyson等总结出了几个与可溶性表达相关的蛋白质特征，包括蛋白的分子量、毗邻的疏水氨基酸个数、低复杂性区域，而与蛋白的等电点、疏水性平均值(GRAVY)和亚细胞定位无关。N端融合硫氧还蛋白和MBP可以最有效的促进蛋白的可溶性表达，C端的融合标签中MBP最为有效。使用H10-MBP融合(MBP前面加上10个组氨酸的标签)，95个蛋白中有63个蛋白可溶性表达的水平大于1mg/l，未成功表达的蛋白大多具有分子量高、毗邻疏水氨基酸个数多和低复杂性区域多的特征，进一步验证了前面的结论。所以作者建议如果蛋白具有如下特征：分子量小于30KDa，只含有1或很少数的低复杂性区域，毗邻疏水氨基酸少于4个，通用的策略是进行N端硫氧还蛋白和MBP融合或C端MBP融合，对于大于50KDa的蛋白，有效的策略是将蛋白质切割表达不同的结构域(107)。

1. 结语

在下游处理过程中，高效的层析技术组成了蛋白质分离纯化的骨架，亲和的策略在过去的几十年里得到了快速的发展和广泛的应用，大大简化了纯化的流程，降低了纯化的难度，充分体现了下游技术和上游策略的紧密结合。下游的纯化工艺应当立足于对纯化蛋白质的最终要求，如纯度、稳定性和用途。另外要考虑的就是原材料的性质，包括来源于什么表达系统(如细菌、酵母、哺乳动物细胞)，主要的杂蛋白(如宿主细胞蛋白、产品的不同变体)，需要处理的固体(如细胞、膜碎片、包涵体)，以及蛋白的性质(如所带电荷、滴定曲线、等电点、分子量、表面疏水性、特异的结合特性和热稳定性)，这些信息都有助于每一步分离纯化工艺的开发。

从我们的论述中，可以看到要得到重组蛋白，可以通过多种途径，有很多表达纯化系统可供选择，各种系统各有特点和优缺点，这时就要综合考虑。即使是设计好了表达纯化系统，在实际的应用中会遇到新的问题，如选用的表达系统表达水平很低，这种低的表达水平是否在纯化上具有优势，GST融合蛋白可能不是可溶性表达而是包涵体，预先选用的酶切位点存在非特异性酶切，在所用的洗脱条件下蛋白质不稳定，这时就要要根据实际情况来解决问题。