学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。
限制性核酸内切酶：
是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。
琼脂糖凝胶电泳：
是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状DNA的迁移率，因此采用不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的DNA片段。
EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐, (Ethidium Bromide)。它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNA。
质粒 pCMV-Myc-T10 NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder) EcoR1 和 Xho1 核酸内切酶(Takara) EcoR 1和 Xho 1酶解缓冲液(10×H buffer) 琼脂糖 TBE或TAE缓冲液(10×) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上样液(6×)：0.25% 溴酚兰，40%(W/V)蔗糖 水溶液或30%的甘油。 电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等 .
1) 质粒DNA的酶解(自提质粒pCMV-Myc-T10)
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质粒量(ng) |
缓冲液(μl)* |
EcoR1(μl) |
Xho1(μl) |
H2O (μl) |
总体积(μl) |
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I |
200 |
2 |
0 |
0 |
17-19 |
20 |
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II |
200 |
2 |
0.5 |
0 |
15-17 |
20 |
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III |
200 |
2 |
0.5 |
0.5 |
14-16 |
20 |
* 缓冲液随不同的酶而不同,本实验用 H buffer。 置于37℃水浴酶解0.5-1小时。酶解完成后，分鸺尤?0?l 3倍的上样缓冲液, 然后各取15?l进行电泳分析。
2) 琼脂糖凝胶的制备:
称取0.8g琼脂糖，置于三角瓶中，加入100ml TBE或TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。
3)胶板的制备:
取有机玻璃内槽，洗净、晾干;取纸胶条(宽约1cm)，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。 将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5-1×TAE(Tris-乙酸) 或TBE(Tris-硼酸)工作液的电泳槽中使用。
4)加样:
用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约15～20 ul。1 kb DNA ladder(共10条带): 在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入6ul 的 1 kb DNA ladder(50ng/ul )。
5)电泳(带上手套操作):
加完样后的凝胶板即可通电进行电泳;
建议在80～100V的电压下电泳;
当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳;
将凝胶放入溴化乙啶(EB〕工作液(0.5ug/ml左右)中染色约20min。